幽門螺桿菌對(duì)甲硝唑的耐藥性分析＊

張 姝，莫 非，孫朝琴，張 然，王 瑩，李 寅，羅昭遜，夏曙華

幽門螺桿菌是淺表性胃炎、消化性潰瘍的致病因子，與胃癌、胃粘膜相關(guān)性淋巴組織淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)［1］。目前治療和控制Hp感染的主要手段是抗生素治療，在治療Hp感染的抗生素中以甲硝唑應(yīng)用最廣，隨著甲硝唑的廣泛應(yīng)用，其耐藥性問題日益突出，已成為治療失敗的主要原因之一［2］。Hp對(duì)甲硝唑耐藥機(jī)制尚未完全明了，目前主要認(rèn)為對(duì)氧不敏感的NADPH硝基還原酶（Rdx A）失活是導(dǎo)致甲硝唑耐藥的關(guān)鍵，該酶的編碼基因?yàn)閞dx A基因［3］。有文獻(xiàn)報(bào)道參與Hp對(duì)甲硝唑耐藥的硝基還原酶還包括：3種鐵氧還蛋白類似物（Fdx B）、NADPH 黃素氧還酶（Frx A）等［4－5］。但在 Hp耐甲硝唑機(jī)制的研究中，對(duì)fdx B和frx A的報(bào)道甚少，本文擬采用PCR擴(kuò)增rdx A、fdxB和frx A基因，并對(duì)這3個(gè)基因測(cè)序分析，探討Hp對(duì)甲硝唑耐藥與rdx A、frx A和fdx B點(diǎn)突變的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 采自貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，60例患者因胃部不適行胃鏡檢查，標(biāo)本取自其胃竇部或胃體部粘膜，并且C14尿素呼氣試驗(yàn)為陽性的情況下，進(jìn)行Hp的分離培養(yǎng)所得。國際標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序株Hp26695株購自ATCC。

1.2 主要試劑 E－Test試驗(yàn)條、微需氧袋：法國梅里埃公司；哥倫比亞血瓊脂粉：OXOID；DNA提取試劑盒：北京天恩澤基因科技有限公司。

1.3 Hp的分離培養(yǎng)及鑒定 取胃竇部內(nèi)鏡活檢組織，接種于幽門螺桿菌選擇培養(yǎng)基平板，微需氧37℃培養(yǎng)3～7 d，進(jìn)行Hp鑒定及培養(yǎng)。

1.4 藥敏試驗(yàn) 采用E－Test法檢測(cè)Hp對(duì)甲硝唑的最低抑菌濃度（MIC）。用 Hp標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序株Hp26695作每批試驗(yàn)的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。以MIC值≥8 μg/m L判定為甲硝唑耐藥，MIC值≥32μg/m L判定為高水平甲硝唑耐藥［6］。

1.5 Hp基因組DNA提取 提取DNA按照試劑盒說明書操作。用紫外分光光度計(jì)對(duì)提取的DNA純度進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算 OD260nm/OD280nm比值。模板DNA于1.0%瓊脂糖凝膠孔中電泳。

1.6 PCR 擴(kuò)增 根據(jù)文獻(xiàn)［7］設(shè)計(jì)rdx A、fdx B和frx A基因的特異性引物，見表1。引物由上海生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為反應(yīng)體系為50μL，其中包括：dd H2O 19μL，上游引2μL，下游引物2μL，模板DNA 2μL，Primix Teq 25μL。循環(huán)條件：預(yù)變形94℃，5 min；變性94℃，30 s；退火53.7℃（其中fdx B退火59℃～60℃，frx A退火59℃～60℃）；延伸72℃2 min；最終延伸72℃，10 min。每次擴(kuò)增時(shí)均設(shè)置陽性對(duì)照、陰性對(duì)照及空白對(duì)照。最后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

表1 rdx A、fdxB、frx A引物序列Tab.1 Primers of rdxA，fdxB and frx A

1.7 PCR產(chǎn)物測(cè)序及序列分析 PCR產(chǎn)物送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）中的BLAST軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1 Hp的培養(yǎng)及藥敏結(jié)果 60例病人胃粘膜標(biāo)本分離出11株Hp，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢呈陰性，菌體細(xì)長彎曲呈螺形，S型或海鷗型。過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、氧化酶實(shí)驗(yàn)及尿素酶實(shí)驗(yàn)，均為陽性。采用ETest法測(cè)定11株臨床株對(duì)甲硝唑的MIC均≥256 μg/m L，為高水平耐藥株。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果 11株臨床株和國際標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序株Hp26695的DNA純度經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定，260 nm/280 nm比值均在1.8～2.0之間。PCR擴(kuò)增出11株臨床株和1株標(biāo)準(zhǔn)株rdx A、frx A和fdxB基因，分別在750 bp、870 bp、830 bp位置出現(xiàn)特異條帶，見圖1。

圖1 模板DNA及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖注：A圖為模板DNA；B圖為rdx A；C圖為fdxB；D圖為frx A；M：DNA marker；陰：陰性對(duì)照；陽：標(biāo)準(zhǔn)株Hp26695；其余為臨床株。Fig.1 Agarose gel electrophoresis maps of DNA templates and PCR amplification productsNote：Picture A for DNA templates；B for rdx A；C for fdxB；D for frx A；M for marker，positive for the standard strain Hp26695，the rest for clinical strains

2.3 產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果 11株臨床株與NCBI已登錄的國際標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序株Hp26695相應(yīng)基因組序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)rdx A、fdx B、frx A基因存在堿基替換、插入和缺失3種類型的突變，這些基因突變呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性，即在某些位點(diǎn)存在共同突變（共同突變位點(diǎn)見表1），除此，還存在隨機(jī)位點(diǎn)的散在突變。耐藥菌與敏感菌核苷酸同源性：rdx A和fdxB為95%～98%，frx A低于94%。

3 討 論

硝基咪唑類藥物甲硝唑（MTZ）是一種具有抑菌活性的藥物前體，經(jīng)Hp的細(xì)胞膜被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入胞漿，在胞漿中的硝基還原酶的作用下，能獲得低于－430 m V氧化還原電位，使甲硝唑的硝基還原成羥胺衍生物，還原產(chǎn)物與DNA作用引起鏈斷裂，導(dǎo)致細(xì)菌死亡，這是甲硝唑的抗Hp機(jī)制［3，8］。因其殺菌活性不受胃內(nèi)低p H的影響，在胃腔內(nèi)濃度高，具有較強(qiáng)的抗Hp活性，因此常用于Hp感染的一線治療［9］，是三聯(lián)方案中最廣泛應(yīng)用的抗菌素之一。隨著抗生素的廣泛使用，Hp對(duì)甲硝唑的耐藥率呈逐年上升趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)從60例病人胃粘膜標(biāo)本分離出11株Hp菌株，采用E－Test法測(cè)定11株臨床株對(duì)甲硝唑的MIC均≥256μg/m L，均為高水平耐藥株。

表2 11株耐藥菌rdx A、fdxB和frxA基因的相同突變位點(diǎn)和突變形式Tab.2 The same mutations sites and forms of rdxA，fdxB and frx A in 11 resistant strains

Kwon等研究表明Hp對(duì)甲硝唑耐藥與編碼參與甲硝唑氧化還原反應(yīng)的酶的基因（rdx A、frx A、fdx B）突變有關(guān)［10］。這些基因的堿基插入、缺失、轉(zhuǎn)化等導(dǎo)致下游氨基酸序列全部或部分發(fā)生改變，導(dǎo)致其翻譯的蛋白質(zhì)改變，引起硝基還原酶活性降低或失活，不能還原甲硝唑而引起耐藥。但對(duì)氧不敏感的NADPH硝基還原酶（Rdx A）最為關(guān)鍵，國外有研究表明，耐甲硝唑的Hp中的Rdx A蛋白缺失或生成減少［11－12］。本研究對(duì)11株耐藥菌和1株敏感菌進(jìn)行rdx A擴(kuò)增并測(cè)序，發(fā)現(xiàn)11株耐藥菌均存在插入、缺失和堿基轉(zhuǎn)換3種突變類型，以堿基轉(zhuǎn)換為突變的主要類型，未發(fā)現(xiàn)大片段序列插入或缺失，只出現(xiàn)單個(gè)堿基插入或缺失，即均表現(xiàn)為點(diǎn)突變。已有報(bào)道認(rèn)為耐甲硝唑Hp菌株的rdx A基因突變大多為隨機(jī)性的，未能肯定某一位點(diǎn)突變與耐藥直接相關(guān)［13］。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)rdx A基因變異位點(diǎn)大多不固定，但11株耐藥菌存在4個(gè)固定的突變位點(diǎn)，即均發(fā)生了1013598nt A→G，1013619nt G→A，1013961nt C→T，1014149nt A→G，這些位點(diǎn)的改變均未見文獻(xiàn)報(bào)道，我們推測(cè)這些位點(diǎn)的突變與甲硝唑的耐藥可能有密切的關(guān)系。

Hp的frx A基因和fdx B基因的變異在Hp對(duì)甲硝唑中－高度耐藥中發(fā)揮重要作用［4］。有研究證實(shí)單一fdx B基因突變導(dǎo)致Hp對(duì)甲硝唑的低水平的耐藥甚至不耐藥，rdx A或frx A基因突變會(huì)產(chǎn)生中等程度的耐藥，但當(dāng)rdx A與fdx B或frx A聯(lián)合突變則會(huì)產(chǎn)生高水平耐藥［10，14］。本文對(duì)11株高水平耐藥菌的frx A基因和fdx B基因進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)耐藥株和標(biāo)準(zhǔn)株均攜帶有frx A和fdx B基因，且發(fā)生不同程度的變異，多表現(xiàn)為隨機(jī)位點(diǎn)的插入、缺失、轉(zhuǎn)化及顛換，未發(fā)現(xiàn)大片基因的插入，但是同時(shí)也呈現(xiàn)出一些規(guī)律性的變化，如：frx A基因測(cè)序結(jié)果在以下3個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)了共同突變：688585nt T插入，688470nt C→T，688041nt T→C，同源性為95%～98%；fdx B的基因測(cè)序結(jié)果表明，11株高水平的耐藥株均發(fā)生變異，有以下共同突變位點(diǎn)，即 1581618nt處 G→A，1581795ntC→T，1581996nt T→C，1582038nt T→C，同源性低于94%。我們推測(cè)這些高頻的突變位點(diǎn)可能在該基因所編碼的蛋白產(chǎn)物失活中起重要作用。從本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，11株高水平耐甲硝唑的Hp菌同時(shí)發(fā)生了rdx A、frx A和fdx B基因突變，這在一定程度上證實(shí)了frx A和fdx B基因突變?cè)趓dx A基因突變所誘導(dǎo)的甲硝唑耐藥中起協(xié)同作用。frx A基因和fdx B在甲硝唑耐藥中是否單獨(dú)起作用還需要增加甲硝唑敏感株，需要更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)去做進(jìn)一步的研究。

研究Hp對(duì)甲硝唑的耐藥機(jī)制可揭示藥物作用細(xì)菌后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，為個(gè)體化用藥以及選擇合適的抗生素用于臨床治療奠定基礎(chǔ)。本文從基因組角度探討Hp對(duì)甲硝唑耐藥的分子機(jī)制，提示了Hp對(duì)甲硝唑耐藥性不僅可能與rdx A點(diǎn)突變有關(guān)，同時(shí)亦可能與frx A和fdxB基因突變相關(guān)。為進(jìn)一步研究和分析Hp耐藥機(jī)制提供了有價(jià)值的資料。

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