烏司他丁對(duì)急性下肢缺血再灌注致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響

張 劍,王虎山,李春萍,金立民,麻海春

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院麻醉科,吉林長(zhǎng)春 130021）

臨床上大多數(shù)血管性疾病發(fā)生的始發(fā)因素和基本過(guò)程均為血管內(nèi)皮損傷。循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(Circulating Endothelial Cells,CEC）是指外周循環(huán)血中測(cè)得的血管內(nèi)皮細(xì)胞,我們可以通過(guò)觀(guān)察其計(jì)數(shù)的變化推測(cè)血管內(nèi)皮(Vein Endothelial Cells,VEC）受損的程度,是通過(guò)非創(chuàng)傷性方法獲得的VEC損傷的特異標(biāo)志物[1]。有報(bào)道證實(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞在缺血再灌注損傷的發(fā)生和進(jìn)展中起關(guān)鍵作用[2]。烏司他丁可抑制多種水解酶活性,減少缺血再灌注損傷中的各種炎性介質(zhì)的釋放,同時(shí)可以清除氧自由基及內(nèi)毒素[3]。本研究從測(cè)定血漿丙二醛(MDA）濃度、肌酸激酶(CK）活性、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)(CEC）入手,觀(guān)察烏司他丁對(duì)急性下肢缺血/再灌注對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者簽署知情同意書(shū)。隨機(jī)選擇40例急性股動(dòng)脈栓塞手術(shù)取栓患者,ASAⅠ-Ⅱ級(jí),年齡28-62歲,體重50-80 kg,下肢缺血時(shí)間5-9小時(shí),無(wú)高血壓、冠心病、無(wú)嚴(yán)重肝腎功能障礙、無(wú)藥物過(guò)敏史或過(guò)敏體質(zhì)。隨機(jī)分為缺血/再灌注組(C組,n=20）,烏司他丁治療組(U組,n=20）。

患者入室后建立靜脈通路同時(shí)抽取肘正中靜脈血4 ml備用。U組靜脈注射烏司他丁20萬(wàn)單位,C組在相同時(shí)刻靜脈等毫升生理鹽水。對(duì)患者實(shí)施硬膜外麻醉,選擇L3-4間隙穿刺,于硬膜外腔內(nèi)向頭側(cè)置管3 cm?；謴?fù)仰臥后,經(jīng)導(dǎo)管注射2%利多卡因3 ml,確認(rèn)無(wú)全脊髓麻醉及局麻藥入血后,追加0.67%羅哌卡因6 ml,針刺法確定麻醉效果后行股動(dòng)脈切開(kāi)取栓術(shù)。常規(guī)持續(xù)監(jiān)測(cè)心率(HR）、血壓(BP）、脈搏氧飽和度(SpO2）、呼吸頻率(RR）和記錄失血量、尿量、輸液量。

術(shù)中U組于動(dòng)脈再通即時(shí)靜脈追加烏司他丁10萬(wàn)單位,C組在相同時(shí)刻靜脈注射等量0.9%氯化鈉注射液。術(shù)后U組再通12 h時(shí)烏司他丁10萬(wàn)單位溶于500 ml 0.9%氯化鈉注射液靜點(diǎn),C組0.9%氯化鈉注射液500 ml靜點(diǎn)。

1.2 觀(guān)察項(xiàng)目

分別于第一次靜脈注射烏司他丁前(T0）、取栓后 30min(T1）、第12 h(T2）、第 24 h(T3）、第 3天(T4）、第7天(T5）抽取肘正中靜脈血測(cè)定血漿丙二醛(MDA）濃度、肌酸激酶(CK）活性、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)(CEC）。循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)(CEC）采用超速離心法。將抗凝劑(3.8%枸櫞酸鈉）0.4 mL與靜脈血1.6 ml加入抗凝管內(nèi),充分混合后離心20min(2 350 r/min）,將上清液取出加0.1%5′-腺苷二磷酸鈉0.2 ml充分混合后離心20 min(2 350 r/min）,加生理鹽水適量至上清液0.1 ml搖勻后靜置10 min,滴在蓋玻片上,計(jì)算1 mm3內(nèi)的脫落內(nèi)皮細(xì)胞(設(shè)備為復(fù)星診斷超高倍顯微診斷系統(tǒng)ACT-2000）。最終數(shù)值取同一標(biāo)本計(jì)數(shù)3次的平均值。

測(cè)定血漿MDA濃度采用改良的硫代巴比妥酸比色法(試劑盒購(gòu)自解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放免研究所）。測(cè)定血清CK的活性應(yīng)用日本日分公司產(chǎn)7150型全自動(dòng)生化分析儀(試劑盒購(gòu)自上海長(zhǎng)征公司）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)注差(ˉx±s）表示,組內(nèi)比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析,組間比較用單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組年齡、性別構(gòu)成、體重、缺血時(shí)間和手術(shù)時(shí)間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）,見(jiàn)表1。

兩組各時(shí)點(diǎn)MDA值、CK活性、CEC值的比較,見(jiàn)表2。與T0時(shí)相比較,C組MDA值在T1-4時(shí)升高(P＜0.05或P＜0.01）,U組MDA值在T2-4時(shí)升高(P＜0.05或P＜0.01）;C組CK活性在T1-4時(shí)升高(P＜0.05或P＜0.01）,U組CK活性在T1-3時(shí)升高(P＜0.05或P＜0.01）,而在T5時(shí)顯著降低(P＜0.01）;C組CEC值T1-4時(shí)升高(P＜0.05或P＜0.01）,U組CEC值在T1-2時(shí)升高(P＜0.05或P＜0.01）,而在T5時(shí)顯著降低(P＜0.01）。

表1 兩組一般情況、缺血時(shí)間及手術(shù)時(shí)間的比較(n=20, ±s）

表1 兩組一般情況、缺血時(shí)間及手術(shù)時(shí)間的比較(n=20, ±s）

組別 年齡(歲）性別構(gòu)成(男/女）體重(kg）缺血時(shí)間(h）手術(shù)時(shí)間(min）C 52±9 12/8 65±11 6.1±1.4 63±15 U 53±7 11/9 67±12 6.3±1.3 61±17

與C組相比較,U組MDA值在T2-4時(shí)顯著降低(P＜0.01）;U組CK活性在T1-5時(shí)顯著降低(P＜0.01）;U組CEC值在T1-4時(shí)顯著降低(P＜0.01）,在T5時(shí)降低(P＜0.05）。

表2 兩組各時(shí)點(diǎn)MDA值、CK活性、CEC值的比較(n=20,±s）

表2 兩組各時(shí)點(diǎn)MDA值、CK活性、CEC值的比較(n=20,±s）

與 T0比較,ΔP＜0.05 Δ ΔP ＜0.01;與C組相比較,*P ＜0.05**P＜0.01

指標(biāo) 組別 T0 T1 T2 T3 T4 T5 MDA(μ mol/L） C 4.17±0.45 4.95±0.81Δ 10.09±0.75Δ Δ 8.85±0.68ΔΔ 7.33±0.47Δ Δ 4.36±0.59 U 4.25±0.39 4.76±0.63 6.83±0.72**ΔΔ 5.77±0.82**Δ Δ 5.21±0.56**Δ Δ 4.28±0.38 CK(U/L） C 272.31±93.35 517.92±99.36ΔΔ 1078.35±115.43Δ Δ 893.29±93.56ΔΔ 627.49±84.25ΔΔ 295.53±103.49 U 259.86±92.57 293.27±76.92**Δ 450.92±70.51**ΔΔ 386.13±83.67**Δ Δ 278.92±73.95** 21.95±98.71**Δ Δ CEC(n/mm3） C 25.47±2.87 38.75±5.48Δ Δ 45.33±4.72Δ Δ 36.74±4.93Δ Δ 33.32 ±6.53ΔΔ 24.63±3.47 U 24.82±3.05 29.08±6.13**Δ 31.16±4.67**ΔΔ 23.61±5.12** 22.37±6.27** 19.62±5.08*Δ

3 討論

急性缺血/再灌注誘發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能異常,使血管內(nèi)膜正常結(jié)構(gòu)的完整性破壞,通透性改變而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹[4]。組織的微循環(huán)受到影響,加重急性缺血/再灌注損傷。

缺血再灌注時(shí),血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生大量的氧自由基,可使細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化,從而破壞細(xì)胞膜的不飽和脂肪酸,形成脂質(zhì)過(guò)氧化物。脂質(zhì)過(guò)氧化物的一類(lèi)終末代謝產(chǎn)物是丙二醛(MDA）,其值可間接反映再灌注損傷的程度。本研究中C組MDA值在T1時(shí)開(kāi)始升高(P＜0.05）、T2-4時(shí)顯著升高(P＜0.01）、T2時(shí)達(dá)峰值,這說(shuō)明了再灌注損傷從T1(再通 30 min）開(kāi)始出現(xiàn),至T2(再通12 h）時(shí)接近峰值,T3(再通24 h）時(shí)開(kāi)始下降。這與韓冰[5]等人的研究結(jié)果相符。C組CEC值T1-4時(shí)顯著升高(P＜0.01）,也是從T1(再通30 min）開(kāi)始出現(xiàn),至T2時(shí)接近峰值,T3時(shí)開(kāi)始下降,MDA值與ECE值有著相同的變化趨勢(shì),這就證實(shí)CEC數(shù)量的變化能間接反映缺血/再灌注損傷的進(jìn)展和嚴(yán)重程度,所以監(jiān)測(cè)CEC數(shù)量的變化對(duì)于應(yīng)用烏司他丁治療缺血/再灌注損傷有指導(dǎo)意義。

正常情況下,骨骼肌細(xì)胞內(nèi)含有豐富的CK,當(dāng)細(xì)胞損傷時(shí),細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞,細(xì)胞內(nèi)酶大量進(jìn)入血液,故血清中CK的含量變化可作為再灌注后骨骼肌損害的指標(biāo)[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示C組CK活性在T1-4時(shí)升高(P＜0.05或P＜0.01）,同時(shí)與ECE值、MDA含量有著相同的變化趨勢(shì)。

烏司他丁是以人尿液為原料提取精制成的廣譜水解酶抑制劑,其通過(guò)穩(wěn)定溶酶體膜,清除氧自由基,抑制炎癥因子釋放等多種作用來(lái)改善組織微循環(huán),減輕缺血/再灌注損傷,保護(hù)作用各組織器官。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與C組比較,U組MDA值在T2-4時(shí)顯著降低(P＜0.01）;U組CK活性在T1-5時(shí)顯著降低(P＜0.01）,且T5時(shí)較T0時(shí)顯著降低(P＜0.01）;U組CEC值在T1-5時(shí)降低(P＜0.01或P＜0.05）,且T5時(shí)較T0時(shí)降低(P＜0.05）。均提示烏司他丁對(duì)缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。

本研究中由于考慮到缺血時(shí)間長(zhǎng)短可能對(duì)缺血再灌注損傷程度產(chǎn)生影響,所以選擇的對(duì)象均為缺血時(shí)間較短的患者(下肢缺血時(shí)間5-9小時(shí)）,但分組嚴(yán)格按照隨機(jī)原則,且兩組平均缺血時(shí)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。然而對(duì)于缺血時(shí)間較長(zhǎng)的患者的治療效果尚有待于進(jìn)一步觀(guān)察。

綜上所述,烏司他丁對(duì)急性下肢缺血再灌注損傷有保護(hù)作用,其機(jī)制可能是烏司他丁在抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞氧自由基的產(chǎn)生的同時(shí)又可降低其對(duì)外源性氧自由基的敏感性,提高了內(nèi)皮細(xì)胞整體抗氧化活性。防御功能增強(qiáng)則損傷脫落入血隨之減輕,微循因而環(huán)得以改善。另外烏司他丁有穩(wěn)定溶酶體膜作用,通過(guò)減少骨骼肌破壞進(jìn)一步提高對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

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