NGF預(yù)處理對AMI大鼠心肌VEGF及其受體KDR/flk-1表達(dá)的影響

李 穎,孫 新,郭華濤,熊 英,翟羽佳,徐 雷

(北華大學(xué)1.附屬醫(yī)院心內(nèi)科,2.生命科學(xué)中心,吉林 吉林市 132011）

近年來研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)生長因子(NGF）家族及其受體在心血管系統(tǒng)中存在廣泛表達(dá),并參與多種心臟疾病的病理生理過程。我們前期的研究表明[1],外源性給予NGF可有效地保護(hù)大鼠心臟交感神經(jīng)支配,可維持一定數(shù)量的神經(jīng)元存活,使心肌損傷壞死面積減少。NGF還可促進(jìn)心臟缺血組織的血管形成。我們擬研究NGF預(yù)處理對大鼠心肌VEGF及其受體KDR/flk-1表達(dá)的影響,探討NGF對心肌損傷修復(fù)的保護(hù)作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型建立雄性成年Wistar大鼠60只,隨機分為3組:NGF預(yù)處理組和非NGF預(yù)處理組和對照組(每組20只）。大鼠NGF預(yù)處理使用注射用鼠神經(jīng)生長因子(0.5 μ g/kg）尾靜脈注射。采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支制作大鼠急性心肌梗死動物模型。于手術(shù)后7天取材。乙醚麻醉下處死動物,大鼠股動脈采血,取大鼠心肌組織,分別做常規(guī)石蠟包埋和即刻液氮冷藏。

1.2 試劑注射用鼠神經(jīng)生長因子購自武漢海特生物制藥股份有限公司;Trizol為美國Invitrogen公司產(chǎn)品;RNA PCRKit(AMV）Ver.3.0試劑盒購自寶生物工程(大連）有限公司;血管內(nèi)皮生長因子(VEGF）及其受體KDR/flk-1 PCR引物由上海英俊生物科技有限公司合成。VEGF引物(495 bp）,上游:5′-tggctttactgctgtacctcc-3′,下游 :5′-acaaatgctttctccgctct-3′;KDR/flk-1 引物(418 bp）,上游 :5′-tcacggttgggctactgc-3′,下游:5′-agaccttctgccatcacg-3′;內(nèi)參 GAPDH 引物 (139 bp）,上游:5′-tatcggacgcctggttac-3′,下游:5′-ctgtgccgttgaacttgc-3′。

1.3 方法

1.3.1 心肌組織病理切片觀察:取心肌標(biāo)本制作石蠟切片,HE染色后觀察形態(tài)學(xué)改變。心肌損傷程度用專用顯微鏡測量及Motic Imaging Previmer醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析。選擇單點彩色分割(放大倍數(shù)為66倍）測定心肌壞死灶面積占心肌總面積的百分?jǐn)?shù)(面密度,%）。

1.3.2 RT-PCR法檢測大鼠心肌組織中VEGF、KDR/flk-1 mRNA表達(dá):Trizol一步法提取凍存心肌總RNA,按TaKaRa RNA PCR Kit(AMV）Ver.3.0試劑盒說明操作,合成并擴增cDNA。擴增反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃,4 min;變性 94℃,30 s,退火 54℃(VEGF、KDR/flk-1）、55℃(GAPDH）,30 s,延伸 72℃,45 s,30個循環(huán);終末延伸72℃,7 min。以Fermentas公司的Gene RulerTM 100 bp DNA Ladder為Marker。用Kodak Digital Science 1D系統(tǒng)進(jìn)行圖像掃描分析,測定大鼠心肌組織中VEGF、KDR/flk-1 mRNA表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理實驗結(jié)果為計量資料,數(shù)據(jù)以ˉx±s表示,用SPSS 14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用方差分析(One-Way ANOVA）,兩組間比較采用t檢驗、多組間兩兩比較采用q檢驗。兩變量之間的關(guān)系應(yīng)用一元線性相關(guān)分析。α=0.05作為差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌組織的病理變化正常對照組大鼠心肌組織病理切片觀察未見異常。非NGF預(yù)處理組大鼠心肌組織損傷、壞死的部位主要在左心室游離壁、心內(nèi)膜下心肌和心尖部等處?？梢姶笃瑺顗乃篮投喟l(fā)灶狀壞死,壞死中心心肌細(xì)胞崩解消失,并有大量炎細(xì)胞浸潤。NGF預(yù)處理組大鼠心肌損傷程度輕,壞死面積小,多呈小灶狀和條狀,局部有少量炎細(xì)胞浸潤,二者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著意義(P＜0.01）。見表1。

表1 大鼠心肌壞死面積病理檢測結(jié)果比較(±s）

表1 大鼠心肌壞死面積病理檢測結(jié)果比較(±s）

注:*與非NGF組比較,P＜0.01;

組別 n 心肌壞死面積(%）NGF組 20 25.41±9.06*非NGF組 20 40.08±11.38

2.2 大鼠心肌組織中VEGF和KDR/flk-1的mR-NA表達(dá)大鼠心肌VEGF mRNA擴增產(chǎn)物電泳可見3個條帶(260-500 bp）,對應(yīng)VEGF的三個亞型VEGF120、VEGF164 和 VEGF188。VEGF mRNA 和KDR/flk-1的mRNA(407 bp）的表達(dá)在對照組的表達(dá)水平很低,心梗后升高,NGF預(yù)處理組也高于非NGF預(yù)處理組(P＜0.01）;各實驗組大鼠心肌中VEGF和KDR/flk-1mRNA表達(dá)光密度比值的統(tǒng)計結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠心肌中VEGF和KDR/flk-1 mRNA表達(dá)結(jié)果比較(±s,%）

表2 各組大鼠心肌中VEGF和KDR/flk-1 mRNA表達(dá)結(jié)果比較(±s,%）

注:*與非NGF組比較,P＜0.01.

組別 n VEGF/GAPDH KDR/flk-1/GAPDH對照組 20 4.06±3.07 5.18±4.76 NGF組 20 45.41±11.54* 47.40±7.83*非NGF組 20 32.34±8.10 31.08±7.88

2.3 相關(guān)分析大鼠心肌VEGF mRNA表達(dá)與KDR/flk-1mRNA表達(dá)之間呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.691,P＜0.01）。說明大鼠心肌中VEGF mRNA表達(dá)與KDR/flk-1mRNA表達(dá)同步上調(diào)。

3 討論

我們的結(jié)果表明,NGF預(yù)處理組大鼠心肌損傷程度輕,壞死面積小。對照組大鼠心肌中VEGF及其受體KDR/flk-1的表達(dá)水平都很低,心梗后其表達(dá)水平上調(diào),NGF預(yù)處理組更是明顯高于非NGF預(yù)處理組。NGF預(yù)處理可能通過上調(diào)VEGF水平促進(jìn)血管新生,減輕大鼠心肌損傷,從而產(chǎn)生保護(hù)作用。Calza等[2]通過對新生大鼠頸上神經(jīng)節(jié)(SCG）的研究發(fā)現(xiàn),NGF不僅可促進(jìn)SCG內(nèi)神經(jīng)元的發(fā)育,而且SCG內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞肥大、增生,血管床面積增大,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)SCG內(nèi)的VEGF表達(dá)也增多。在外周神經(jīng),NGF也同樣可通過促進(jìn)VEGF的表達(dá),間接地促進(jìn)血管形成[3]。Turrini等[4]將狗的股動脈阻斷后,后肢的內(nèi)收肌和腓腸肌缺血,結(jié)果NGF及其受體表達(dá)上調(diào),缺血肢體微動脈的形成較對照組增加90%以上?？梢娺@種內(nèi)源性的NGF釋放增加不僅與神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)修復(fù)作用相關(guān),還可促進(jìn)缺血組織血管形成。體內(nèi)、外實驗均證實NGF可促進(jìn)局部缺血組織的血管形成[5,6,7]。我們的結(jié)果與此一致,也是在微血管及其周圍表達(dá)豐富。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),心肌缺血時VEGF表達(dá)增加可促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的建立[8]。編碼VEGF-165的裸露質(zhì)粒DNA,注射到急性心肌梗死病人的缺血心肌部位,結(jié)果發(fā)現(xiàn)癥狀減輕,心肌血管管徑增加[9]。VEGF還有可能促進(jìn)心肌細(xì)胞的再生[10]。有研究發(fā)現(xiàn),KDR/flk-1和具有活力的心肌組織相關(guān),心梗急性期KDR/flk-1表達(dá)下降[11]。本研究中正常對照組的KDR/flk-1的表達(dá)很低,而心梗后其表達(dá)升高,并沒有表現(xiàn)出急性損傷時的下降,可能是因為我們的研究中并沒有將壞死區(qū)域與正常心肌進(jìn)行比較,而是對整個心臟的綜合指數(shù)進(jìn)行分析;我們的結(jié)果顯示,VEGF和KDR/flk-1mRNA表達(dá)呈正相關(guān),VEGF與其受體平行上調(diào)可增加心肌新生血管密度從而產(chǎn)生心肌保護(hù)作用。

由于嚙齒類動物與高級大型動物之間的差異,以及NGF劑量和干預(yù)時間的不同,NGF在心血管病臨床應(yīng)用方面還需進(jìn)一步深入研究。

[1]李 穎,王 銅,周令望,等.神經(jīng)生長因子對大鼠心肌損傷后交感神經(jīng)去支配及巢蛋白表達(dá)的影響.中國地方病學(xué)雜志,2007,26(2）:152.

[2]Calza L,Giardino L,Giuliani A,et al.Nerve growth factor control of neuronal expression of angiogenetic and vasoactive factors[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2001,98(7）:4160.

[3]Samii A,Unger J,Lange W.Vascular endothelial growth factor expression in peripheral nerves and dorsal root ganglia in diabetic neuropathy in rats[J].Neurosci Lett,1999,262(3）:159.

[4]Turrini P,Gaetano C,Antonelli A,et al.Nerve growth factor induces angiogenic activity in a mouse model of hindlimb ischemia[J].Neurosci Lett,2002,323(2）:109.

[5]DonovanMJ,Miranda RC,Kraemer R.Neurotrophin and neurotrophin receptors in vascular smooth muscle cells.Regulation of expression in response to injury[J].Am J Pathol,1995,147(2）:309.

[6]Tanaka A,Wakita U,Kambe N,et al.An autocrine function of nerve growth factor for cell cycle regulation of vascular endothelial cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,313(4）:1009.

[7]Emanueli C,Salis MB,Pinna A,et al.Nerve growth factorpromotes angiogenesis and arteriogenesis in ischemic hindlimbs[J].Circulation,2002,106(17）:2257.

[8]Schultz A,Lavie L,Hochberg I,et al.Interindividual heterogeneity inthe hypoxic regulation of VEGF:significance for the development of the coronary artery collateral circulation[J].Circulation,1999,100(5）:547.

[9]SarkarN,Ruck A,Kallner G,et al.Effects of intramyocardial injection of phVEGF-A165 as sole therapy in patients with refractory coronary artery disease--12-month follow-up:angiogenic gene therapy[J].J Intern Med,2001,250(5）:373.

[10]Laguens R,Cabeza Meckert P,Vera Janavel G,et al.Entrance in mitosis of adult cardiomyocytes in ischemic pig hearts after plasmid-mediated rhVEGF165 gene transfer[J].Gene Ther,2002,9(24）:1676.

[11]Sugishita Y,Takahashi T,Shimizu T,et al.Expression of genes encoding vascular endothelial growth factor and itsFlk-1 receptor in the chick embryonic heart[J].J Mol Cell Cardiol,2000,32(6）:1039.