CpG ODN聯(lián)合凋亡腫瘤細(xì)胞相關(guān)抗原致敏樹(shù)突狀細(xì)胞殺傷SKOV3卵巢癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

葉明珠,李 娜,黃秀敏

(廈門(mén)大學(xué)附屬中山醫(yī)院婦產(chǎn)科,福建廈門(mén) 361004）

腫瘤免疫的最終目的即達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞、阻止腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。以往單純利用凋亡腫瘤細(xì)胞作為腫瘤免疫的初始抗原,其因抗原性弱,難以達(dá)到理想的抗腫瘤免疫效果。近年來(lái)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明,人工模擬細(xì)菌基因組DNA合成的含有至少一個(gè)未甲基化“CpG基序”的單鏈寡脫氧核苷酸是一類新型的免疫制劑,具有強(qiáng)效的免疫刺激功能。它能夠以病原相關(guān)的分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP）,促進(jìn)多種免疫細(xì)胞的活化,進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)及持久的保護(hù)性免疫反應(yīng)[1]。本研究采用人工合成的CpG ODN2006聯(lián)合凋亡的SKOV3卵巢癌細(xì)胞相關(guān)抗原(tumor associated antigens,TAAs）體外沖擊致敏DCs,探討CpG ODN對(duì)DCs促分化成熟的作用;同時(shí)體外觀察致敏DCs對(duì)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs）殺傷SKOV3卵巢癌細(xì)胞活性的影響,以期為CpG ODN聯(lián)合TAAs在抗卵巢癌免疫中的應(yīng)用提供一些重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料人外周血每份20 ml,肝素抗凝;人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3、人宮頸癌細(xì)胞株Hela、人肺癌細(xì)胞株Lewis由吉林大學(xué)病理教研室提供。

1.2 主要試劑CpG-ODN2006(5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3'）,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,全硫代磷酸化修飾,PAGE純化。MTT(華美生物工程公司）;絲裂霉素C(Sigma公司）;異硫氰酸熒光素(FITC）標(biāo)記的CD1α、CD83、CD86和HLA-DR 單克隆抗體(BD Pharmingen公司）;GM-CSF/IL-4(Sigma Aderch公司）;IL-12 ELISA試劑盒(晶美生物工程有限公司）;RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco公司）;淋巴細(xì)胞分離液(鼎國(guó)試劑公司）。

1.3 方法

1.3.1 人外周血單核細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 取人外周血20 ml,肝素抗凝,用等體積Hanks液稀釋后加入淋巴細(xì)胞分離液,1 500 r/min離心15 min,吸取界面細(xì)胞即獲得外周血單核細(xì)胞,PBS洗滌2次。將獲得的外周血單核細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為2.0×106/mL,置37℃,5%CO2孵箱培養(yǎng)2 h,洗去未貼壁細(xì)胞,獲得貼壁的單核細(xì)胞,每孔加入含GM-CSF1000 KU/L、IL-41000 KU/L的完全培養(yǎng)基,隔天半量換液。第7天收集疏松粘附細(xì)胞,即為DC。倒置顯微鏡下觀察DC的形態(tài)及生長(zhǎng)情況。

1.3.2 TAAs的制備 將貼壁對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的SKOV3卵巢癌細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后,加入RPMI1640完全培養(yǎng)基,調(diào)細(xì)胞濃度為1.0×108/L,接種于96孔板,每孔100 μ L,置37℃,5%CO2孵箱培養(yǎng)。收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞,調(diào)細(xì)胞濃度為1.0×1010/L,1 000 r/min離心5 min,沉淀用含10%胎牛血清的 RPMI1640懸浮,反復(fù)凍融(-80℃/37℃）3次,15 000 r/min離心30 min,收集上清液微孔濾膜過(guò)濾作為T(mén)AAs。

1.3.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CpG ODN致敏DCs表面分子的表達(dá)以完全培養(yǎng)基調(diào)DCs濃度至1×109/L,于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入1 ml。分別加入10 mg/LCpG ODN 、10 mg/L TAA 、10 mg/LCpG ODN+10 mg/L TAA,設(shè)LPS陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照。培養(yǎng)72h后收集細(xì)胞,FACS檢測(cè)細(xì)胞表面CD1α、CD83、CD86和HLA-DR表達(dá)水平,計(jì)算熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。

1.3.4 ELISA法檢測(cè)IL-12分泌水平 收集上述各組DCs的培養(yǎng)上清液,按ELISA試劑盒說(shuō)明檢測(cè)各組DC培養(yǎng)上清液中IL-12的分泌水平,酶標(biāo)儀測(cè)定490nm波長(zhǎng)下的吸光度值,計(jì)算IL-12的濃度。

1.3.5 T淋巴細(xì)胞的制備 將貼壁培養(yǎng)DCs后獲得的非貼壁細(xì)胞經(jīng)尼龍毛柱過(guò)濾后粘附去除B淋巴細(xì)胞,洗脫后所得細(xì)胞主要為T(mén)淋巴細(xì)胞。

1.3.6 測(cè)定致敏DCs對(duì)T淋巴細(xì)胞的增殖活性 將培養(yǎng)的各組DCs經(jīng)絲裂霉素C處理30 min后,重懸于完全培養(yǎng)基中,分別以每孔2×105、1×105、5×104加入96孔板;另將獲得的T淋巴細(xì)胞用完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度 1×109/L,加入96孔板,每孔 100 μ l,總反應(yīng)體積 200 μ l。置 37℃,5%CO2孵箱培養(yǎng) 5天。于培養(yǎng)結(jié)束前4 h以淋巴細(xì)胞加培養(yǎng)液作為對(duì)照組進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixed lymphocyte reaction,MLR）。加入 MTT(5 g/L）20 μ l,37℃,5%CO2繼續(xù)孵育,4 h后棄去上清,加入DMSO 100 μ l,30 min后用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)在570 nm處的吸光度(A值）,增值活性以刺激指數(shù)(stimulate index,SI）表示:SI=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值。

1.3.7 致敏DCs誘導(dǎo)CTLs殺傷活性的檢測(cè) 將獲得的T淋巴細(xì)胞用完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為1×109/L,作為效應(yīng)細(xì)胞。(1）CTLs殺傷活性的檢測(cè):在96孔板中分別加入T淋巴細(xì)胞100 μ l(每孔1×105）,按照不同效靶比(80∶1、40∶1、20∶1、10∶1）加入SKOV3細(xì)胞,總反應(yīng)體積200 μ l。在反應(yīng)體系中分別加入 unpulsed-DCs、CpG ODN-pulsed-DCs、CpG ODN+TAA-pulsed-DCs、TAA-pulsed-DCs,每孔 1×104。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)48 h,MTT比色試驗(yàn)法測(cè)定各孔A值,單純效靶細(xì)胞共育作為對(duì)照。(2）CTLs特異性殺傷活性的檢測(cè):在96孔板中分別加入T淋巴細(xì)胞100 μ l(每孔 2×105）,按照不同效靶比(80∶1、40∶1、20∶1、10∶1）分別加入 SKOV3 細(xì)胞 、Hela細(xì)胞和Lewis細(xì)胞,總反應(yīng)體積200 μ l。在反應(yīng)體系中加入CpG ODN+TAA-pulsed-DCs,每孔1×104,每組設(shè) 4個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)48 h,殺傷率按下列公式計(jì)算:殺傷率=100%×[1-(實(shí)驗(yàn)組A值-效應(yīng)細(xì)胞組A值）/靶細(xì)胞A值]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果以(ˉx±s）表示,采用方差分析、LSD 檢驗(yàn)等方法。

2 結(jié)果

2.1 ODN2006致敏DCs表型功能分析FACS測(cè)定結(jié)果顯示,培養(yǎng)72 h后CpG ODN-pulsed-DCs和CpG ODN+TAA-pulsed-DCs的表型發(fā)生明顯變化,其表面分子CD83、CD86和HLA-DR的表達(dá)明顯上調(diào),三者陽(yáng)性細(xì)胞百分率均顯著高于unpulsed-DC組,而CD1α在各組間表達(dá)水平無(wú)明顯差別。致敏DCs培養(yǎng)上清中IL-12分泌水平測(cè)定結(jié)果顯示:unpulsed-DC組、TAA-pulsed-DC組培養(yǎng)上清液中IL-12的分泌水平為(60±9）ng/L和(86±13）ng/L,而在CpG ODN-pulsed-DC組和CpG ODN+TAA-pulsed-DC組培養(yǎng)上清液中IL-12水平顯著增加,分別為(375±32）ng/L和(437±65）ng/L,二者與 unpulsed-DC組和TAA-pulsed-DC組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01）。

2.3 ODN2006對(duì)DCs刺激T淋巴細(xì)胞增殖的影響各種致敏因素誘導(dǎo)的DCs均可不同程度地刺激T淋巴細(xì)胞的增殖,且隨著致敏DCs密度的增加,其T細(xì)胞的增殖活性逐漸增強(qiáng)。CpG ODN-pulsed-DC組和CpG ODN+TAA-pulsed-DC組在相同效靶比下對(duì)T淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)均無(wú)顯著性差異(P＞0.05）,但與unpulsed-DC組和TAA-pulsed-DC組相比,當(dāng)T∶DC比值接近10∶1時(shí),差異即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01）,如表1所示。

表1 ODN2006致敏DCs對(duì) T淋巴細(xì)胞增殖活性的影響(SI,±s）

表1 ODN2006致敏DCs對(duì) T淋巴細(xì)胞增殖活性的影響(SI,±s）

注:相同T∶DC比值下,CpG ODN-pulsed-DC組與CpGODN+TAA-pulsed-DC組組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）,*與unpulsed-DC組比較,P＜0.05,△與unpulsed-DC組比較,P＜0.01,#與TAA-pulsed-DC組比較,P＜0.01

組 別 孔數(shù)T∶DC 20∶1 10∶1 1∶1 unpulsed-DC 6 1.07±0.41 1.14±0.50 1.10±0.26 CpG ODN-pulsed-DC 6 1.60±0.28△ 3.12±0.57△# 3.87±0.91△#CpGODN+TAA-pulsed-DC 6 1.81±0.54△# 3.56±0.79△# 4.50.±0.65△#TAA-pulsed-DC 6 1.26±0.37 1.52±0.29* 1.51±0.43*F值 9.402 13.196 24.732 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.4 CTLs對(duì)SKOV3卵巢癌細(xì)胞的殺傷活性通過(guò)測(cè)定各組致敏DCs誘導(dǎo)的CTLs對(duì)SKOV3卵巢癌細(xì)胞的殺傷活性,結(jié)果顯示:CpG ODN+TAA-pulsed-DC組可增強(qiáng)CTLs對(duì)SKOV3細(xì)胞的殺傷能力,相同效靶比下與 unpulsed-DC組、CpG ODN-pulsed-DC組和CA125-pulsed-DC組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01）。當(dāng)效靶比低至20∶1時(shí)即呈現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性,且隨效靶比的升高,殺傷活性逐漸增強(qiáng),殺傷率最高達(dá)56.1%,如表2所示。為進(jìn)一步證實(shí)ODN2006聯(lián)合TAA致敏DCs所誘導(dǎo)的CTLs對(duì)SKOV3細(xì)胞具有特異性殺傷活性,我們測(cè)定了不同效靶比下CpG ODN+TAA-pulsed-DC所誘導(dǎo)的CTLs對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的殺傷率。結(jié)果顯示,該種致敏方式能誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)SKOV3細(xì)胞的特異性殺傷,而對(duì)Hela細(xì)胞和Lewis細(xì)胞無(wú)明顯殺傷活性。

表2 CTLs殺傷SKOV3卵巢癌細(xì)胞的活性比較(%,±s）

表2 CTLs殺傷SKOV3卵巢癌細(xì)胞的活性比較(%,±s）

注:相同效靶比下比較,*與unpulsed-DC組比較,P＜0.01,△與TAA-pulsed-DC組比較,P＜0.01,#與CpG ODN-pulsed-DC組比較,P＜0.01

組別 孔數(shù)效靶比10∶1 20∶1 40∶1 80∶1 unpulsed-DC 5 8.6±1.9 11.7±5.8 11.0±7.2 13.1±8.6 CpG ODN-pulsed-DC 5 10.3±3.7 15.0±3.9 23.9.±8.5*△ 29.7±14.3*△CpGODN+T AA-pulsed-DC 5 13.2±6.4* 24.7±9.0*△# 40.5±11.6*△# 43.9±10.8*△#TAA-pulsed-DC 5 10.8±5.2 13.2±7.1 14.5±9.7 16.2±6.3*F值 18.930 39.161 31.852 34.892 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

3.1 樹(shù)突狀細(xì)胞作為機(jī)體內(nèi)最主要的專職抗原呈遞細(xì)胞(APC）在細(xì)胞免疫應(yīng)答中起著不可替代的作用,其分化成熟與否直接關(guān)系到能否產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫效應(yīng)。然而,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)正常情況下體內(nèi)大多數(shù)DCs都處于非成熟狀態(tài),表達(dá)低水平共刺激分子和粘附分子,體外激發(fā)MLR能力較弱。因而在試圖應(yīng)用DCs進(jìn)行腫瘤免疫靶向治療的研究中急需一種可有效激活DCs、促使DCs由非成熟狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒鞝顟B(tài)的免疫佐劑。近年來(lái)研究顯示,人工模擬細(xì)菌基因組DNA合成的CpG ODN,因其含有非甲基化的CpG基序,可以通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Toll樣受體-9(Toll-like receptors,TLR-9）結(jié)合,誘導(dǎo)多種免疫細(xì)胞特別是B細(xì)胞、pre-DC2的活化、增殖和分化,誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生[2]。本研究直接向外周血來(lái)源的DCs培養(yǎng)環(huán)境中加入了ODN2006,分析比較其對(duì)DCs表面共刺激分子及培養(yǎng)上清液中IL-12分泌水平的影響,發(fā)現(xiàn)添加ODN2006后,表面分子CD83、CD86和HLA-DR的表達(dá)均顯著增高,培養(yǎng)上清液中的IL-12分泌水平也較未刺激組有大幅度的升高,聯(lián)合加入TAA后這種刺激作用進(jìn)一步增強(qiáng),說(shuō)明ODN2006可有效誘導(dǎo)DCs的成熟,促進(jìn)DCs表達(dá)協(xié)同共刺激分子,其與TAA聯(lián)合應(yīng)用能夠產(chǎn)生協(xié)同作用。

3.2 以往的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),許多合成的多肽疫苗可以引起較強(qiáng)的T淋巴細(xì)胞反應(yīng),但是對(duì)于已經(jīng)存在的腫瘤沒(méi)有明顯的殺傷活性,這主要是因?yàn)槊庖呦到y(tǒng)很難將這些可溶性蛋白抗原交叉遞呈給細(xì)胞免疫系統(tǒng)。因此,選擇能夠增強(qiáng)交叉遞呈作用的免疫佐劑將無(wú)疑是抗腫瘤免疫的先決條件。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)ODN2006+TAA致敏后的DCs在同種MLR中均可刺激T淋巴細(xì)胞的大量增殖,與未致敏組和單純TAA致敏組相比有顯著性差異。有研究顯示,CpG ODN對(duì)純化的T細(xì)胞沒(méi)有刺激增殖能力,而體內(nèi)應(yīng)用CpG ODN除了能夠顯著活化CD8+記憶性T細(xì)胞外,對(duì)所有T細(xì)胞均有一定程度的活化,故推測(cè)這種刺激活性可能主要依賴于APC分泌的I型干擾素及IL-12。此外,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CpG ODN可通過(guò)非IFN-R途徑介導(dǎo)DCs分泌大量的I型干擾素。因此,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果,我們推測(cè)CpG ODN可能通過(guò)促進(jìn)DCs分泌I型干擾素和IL-12,進(jìn)而增強(qiáng)DCs的抗原遞呈能力,誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的活化與增殖。

3.3 研究表明,腫瘤細(xì)胞逃逸宿主免疫應(yīng)答的主要原因在于腫瘤細(xì)胞自身具有的免疫原性較弱,不能激發(fā)機(jī)體有效的免疫反應(yīng),因而增加腫瘤疫苗免疫原性的凈效應(yīng)就是要刺激宿主的免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤抗原產(chǎn)生有效的捕獲、加工和遞呈。本研究從凋亡的SKOV3卵巢癌細(xì)胞中提取腫瘤相關(guān)抗原,試圖通過(guò)此種聯(lián)合致敏方式獲得特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng)。經(jīng)研究證實(shí),我們選用的ODN2006與TAA聯(lián)合致敏DCs后可顯著增強(qiáng)CTLs對(duì)SKOV3細(xì)胞的免疫殺傷活性,殺傷率最高達(dá) 56.1%,同時(shí)對(duì)Hela細(xì)胞和Lewis細(xì)胞卻無(wú)明顯的殺傷活性,從而進(jìn)一步說(shuō)明這種聯(lián)合致敏方式所誘導(dǎo)的CTLs對(duì)靶細(xì)胞的殺傷具有抗原特異性。動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)顯示,經(jīng)CpG ODN免疫后的小鼠能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1型免疫反應(yīng),并通過(guò)釋放細(xì)胞因子等激活抗原特異性CD8+T細(xì)胞,進(jìn)而引起CD8+T細(xì)胞依賴性的細(xì)胞毒性反應(yīng)[3-4]。國(guó)外有學(xué)者通過(guò)研究小鼠B16F1黑色素瘤模型發(fā)現(xiàn),將CpG ODN與B16F1腫瘤細(xì)胞聯(lián)合免疫荷瘤小鼠,可誘導(dǎo)產(chǎn)生長(zhǎng)期持續(xù)的CTLs反應(yīng),促使腫瘤消退,延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存期[5]。綜上所述,我們推測(cè)CpG ODN可能通過(guò)增強(qiáng)DCs對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的加工遞呈功能,通過(guò)致敏DCs分泌相關(guān)細(xì)胞因子等促進(jìn)CTLs活化與增殖,進(jìn)而誘導(dǎo)其產(chǎn)生對(duì)SKOV3卵巢癌細(xì)胞的特異性殺傷活性,這為體內(nèi)應(yīng)用CpG ODN和TAA進(jìn)行抗卵巢癌免疫奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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