鈣蛋白酶相關(guān)疾病研究進(jìn)展*

范麗萍 楊明

(1.廣州體育學(xué)院,廣東 廣州 510075;2.樂山市公安局,四川 樂山 614000)

鈣蛋白酶系統(tǒng)主要由鈣蛋白酶(Calpain)和其內(nèi)源性抑制劑蛋白(Calpastatin,CAST)組成,鈣蛋白酶是體內(nèi)除了鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶外另一重要的Ca2+依賴性蛋白酶。鈣蛋白酶屬于半胱氨酸蛋白激酶,不僅參與蛋白質(zhì)水解,還參與肌肉生長與分化、神經(jīng)發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)控與凋亡、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等正常的生理過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶還與肌肉萎縮,缺血再灌注損傷、2型糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及阿爾茨海默病等疾病的發(fā)生有關(guān),隨著研究的深入,鈣蛋白酶成為這些疾病靶向用藥的研究熱點(diǎn)。

1 鈣蛋白酶概述

到目前為止,哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)15種鈣蛋白酶,相關(guān)編碼基因共 15個(gè),其中 13個(gè)編碼 15種大亞基,2個(gè)(Capn4,Capn14)編碼2種小亞基[1]。鈣蛋白酶家族成員互為同工酶,普遍存在于絕大多數(shù)動物細(xì)胞內(nèi),有的分布廣泛,如鈣蛋白酶I(μ-calpain,calpain1)和鈣蛋白酶 II(m—calpain,calpain2);有的則表現(xiàn)出很強(qiáng)的組織特異性,如鈣蛋白酶IIIa(calpain3a)主要分布于骨骼肌,而calpain8a,calpain8b主要分布于胃組織。

鈣蛋白酶由 1個(gè)大亞基(80 k D)和 1個(gè)小亞基(30 kD)組成異二聚體。大亞基有 4個(gè)結(jié)構(gòu)域(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ):結(jié)構(gòu)域Ⅰ位于N一末端,與Ca2+后可發(fā)生自降解,引起蛋白酶構(gòu)象改變;結(jié)構(gòu)域Ⅱ是由Cysl05、His262、Asn286 3個(gè)氨基酸殘基組成酶的活性中心,這與其它的半胱氨酸激酶類似,如 papain,caspase和cathepsins;結(jié)構(gòu)域Ⅲ是抑制蛋白或激活蛋白結(jié)合的部位;結(jié)構(gòu)域Ⅳ是Ca2+結(jié)合的部位,包含5個(gè)與鈣調(diào)素類似的EF-hand模體。小亞基有2個(gè)結(jié)構(gòu)域,結(jié)構(gòu)域Ⅰ富含甘氨酸和疏水氨基酸,是酶與細(xì)胞膜結(jié)合的部位;結(jié)構(gòu)域Ⅱ與大亞基結(jié)構(gòu)域Ⅳ結(jié)構(gòu)相似,也含有Ca2+結(jié)合位點(diǎn)[2-3]。

2 鈣蛋白酶的活性調(diào)節(jié)

鈣蛋白酶的活性依賴于胞漿內(nèi)Ca2+濃度,不同的鈣蛋白酶同工酶對Ca2+濃度要求不同。u-calpain只需微摩爾濃度的Ca2+就可激活,而m-calpain需毫摩爾級的Ca2+濃度才能被激活,正常情況下,細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度在0.1～5μmol·L-1之間,主要激活前者[4]。Ca2+對鈣蛋白酶的激活過程分為兩步,首先是Ca2+與大亞基的結(jié)構(gòu)域Ⅲ,結(jié)構(gòu)域Ⅳ和小亞基的結(jié)構(gòu)域Ⅱ結(jié)合,引起大亞基變構(gòu)。第二步是變構(gòu)的大亞基的結(jié)構(gòu)域Ⅱ組成酶活性部位水解底物蛋白。

在較高的Ca2+濃度作用下,鈣蛋白酶還可以發(fā)生自溶作用,分解為只需低濃度Ca2+濃度維持的有活性亞單位。研究發(fā)現(xiàn)[5],正常情況下 u-calpain需要 2-200μM 的Ca2+才能激活,然而一旦激活發(fā)生自溶時(shí),全長80 k D的u-calpain降解為76 kD或78 k D的片段,該降解片段僅需0.5-2μM 的Ca2+維持活性。與此類似,骨骼肌特異的P94(Calpain3)也可自降解為56 k D、58 k D或60 kD的片段,同樣只需較低的Ca2+濃度即可維持。因此,鈣蛋白酶的自溶作用對活性起到調(diào)節(jié)作用,但到目前為止具體機(jī)制仍不清楚。

3 鈣蛋白酶相關(guān)疾病

鈣蛋白酶系統(tǒng)作為機(jī)體細(xì)胞內(nèi)蛋白降解的主要酶系之一,對維持體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的平衡起著重要的作用。鈣蛋白酶含量的提高或活性的增強(qiáng)時(shí)均可導(dǎo)致蛋白分解大于合成,機(jī)體呈現(xiàn)負(fù)氮平衡,反之則會導(dǎo)致體內(nèi)陳舊、毀損的蛋白無法及時(shí)更新。上述兩種情況下,均可導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化和功能障礙,另外鈣蛋白酶還是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長,代謝過程的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子

3.1 鈣蛋白酶與骨骼肌萎縮

骨骼肌萎縮過程與肌原纖維蛋白分解增強(qiáng)密切相關(guān),負(fù)責(zé)肌原纖維蛋白降解的主要是泛素-蛋白酶體和鈣蛋白酶系統(tǒng)。泛素-蛋白酶體可以降解細(xì)胞內(nèi)80%以上的胞內(nèi)蛋白,但對于完整的肌原纖維并不起作用。鈣蛋白酶系統(tǒng)系統(tǒng)負(fù)責(zé)將肌原纖維劈裂成可降解的肌絲片段,而后泛素-蛋白酶體才能降降解這些蛋白[6]。因此,鈣蛋白酶可認(rèn)為是啟動骨骼肌肌原纖維蛋白降解第一步的主要酶系。研究發(fā)現(xiàn),去神經(jīng)、費(fèi)用等原因造成的肌肉萎縮中均發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶活性的提高,而過量表達(dá)沒有活性的m-calpain或者Calpastatin能使大鼠 L8成肌細(xì)胞的蛋白降解速率下降30-63%[7],也有研究表明過量表達(dá)全長的Calpastatin可使轉(zhuǎn)基因小鼠比目魚肌萎縮速度下降30%[8]。

3.2 鈣蛋白酶與缺血再灌注損傷

缺血再灌注損傷時(shí),胞漿的Ca2+濃度明顯增加,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷和功能代謝障礙,稱為鈣超載。缺血再灌注損傷時(shí)鈣超載的機(jī)制主要是Na+/Ca2+交換異常和細(xì)胞膜和肌漿網(wǎng)膜損傷引起Ca2+內(nèi)流。Ca2+濃度增加可以激活鈣蛋白酶促進(jìn)細(xì)胞膜和結(jié)構(gòu)蛋白的損傷。因此,缺血再灌注損傷時(shí)鈣超載和生物膜損傷相互促進(jìn),形成惡性循環(huán)。

研究發(fā)現(xiàn)[9]心肌缺血再灌注損傷時(shí)Calpain1表達(dá)增加,并認(rèn)為Calpain1劈裂激活PKC在缺血再灌注引起心肌梗死中起重要作用,使用鈣蛋白酶抑制劑SNJ-1945可以明顯減少缺血再灌注引起心肌損傷[10]。另外有研究發(fā)現(xiàn)在腎臟移植缺血再灌注損傷時(shí)也有Calpain的激活,使用鈣蛋白酶抑制劑同樣也起到了很好的預(yù)防損傷的作用[11]。

3.3 鈣蛋白酶與阿爾茨海默病

阿爾茨海默病又稱老年癡呆癥。是一種進(jìn)行性發(fā)展的致死性神經(jīng)退行性疾病,臨床表現(xiàn)為認(rèn)知和記憶功能不斷惡化,日常生活能力進(jìn)行性減退,并有各種神經(jīng)精神癥狀和行為障礙。目前比較認(rèn)可的兩種發(fā)病機(jī)制為:其一為由于淀粉樣前蛋白的異常導(dǎo)致蛋白成分漏出細(xì)胞膜,導(dǎo)致神經(jīng)元纖維纏結(jié)和細(xì)胞死亡;其二為與載脂蛋白E(APO-E4)的基因有關(guān),APO-E4使神經(jīng)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性降低,導(dǎo)致神經(jīng)元纖維纏結(jié)和細(xì)胞死亡。

研究發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病患者腦神經(jīng)細(xì)胞鈣離子的濃度和鈣蛋白酶的活性均上升[12],鈣蛋白酶通過劈裂分解周期素依賴激酶-5(CDK-5)和細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)激酶(ERK)激活兩者,最終引起細(xì)胞凋亡;另有研究發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)鈣蛋白酶內(nèi)源抑制劑Capastatin(CAST)能減少神經(jīng)元的凋亡,對神經(jīng)細(xì)胞起到明顯的保護(hù)作用[13]。以上說明鈣蛋白酶在阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

3.4 鈣蛋白酶與糖尿病

隨著生活水平的提高,糖尿病發(fā)病率有上升趨勢,其中2型糖尿病占多數(shù)。該型患者機(jī)體對胰島素反應(yīng)差,因此又稱胰島素抵抗性糖尿病。研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者的Calpain-2的活性亞單位顯著上升[14],這可能是導(dǎo)致胰島B細(xì)胞功能紊亂和凋亡的原因。另外糖尿病的發(fā)生除了與飲食有關(guān)外,遺傳因素也在2型糖尿病的發(fā)生中起作用,對于糖尿病的易感基因,研究較多的就是Calpain-10基因。有研究表明Calpain-10基因突變與2型糖尿病患者的發(fā)生密切相連[15],Calpain-10編碼的蛋白與葡萄糖的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。

3.5 鈣蛋白酶與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎

風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種常見的急性或慢性結(jié)締組織炎癥,可反復(fù)發(fā)作并累及心臟。臨床以關(guān)節(jié)和肌肉游走性酸楚、重著、疼痛為特征,屬變態(tài)反應(yīng)性疾病,是風(fēng)濕熱的主要表現(xiàn)之一,多以急性發(fā)熱及關(guān)節(jié)疼痛起病。研究發(fā)現(xiàn)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者鈣蛋白酶活性增強(qiáng),鈣蛋白酶通過劈裂激活蛋白激酶C(PKC)和炎性介質(zhì) IL-1、IL-6、TNF-α等參與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[16]。而使用鈣蛋白酶抑制劑E-64-d則可明顯抑制實(shí)驗(yàn)大鼠的關(guān)節(jié)炎[17]。

3.6 其他鈣蛋白酶相關(guān)的疾病研究進(jìn)展

除了上述鈣蛋白酶相關(guān)疾病外,在白內(nèi)障患者的晶狀體中發(fā)現(xiàn)Ca2+濃度的提高,鈣蛋白酶被激活,組成晶狀體的細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)、肌動蛋白等被降解,導(dǎo)致白內(nèi)障。另外,研究發(fā)現(xiàn)使用鈣蛋白酶抑制劑或敲除calpain-3的小鼠均可以可以阻止白內(nèi)障的發(fā)生[18-19]。此外,在肌營養(yǎng)不良、腫瘤、燒傷等疾病中也發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶活性的提高[3]。說明鈣蛋白酶可能在上述疾病過程中也發(fā)揮重要作用,具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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