植物多糖中糖醛酸和中性糖分析檢測方法的研究進(jìn)展

陳 輝 和嫻嫻 李浩然

（河北科技大學(xué)，石家莊 050018）

植物多糖中糖醛酸和中性糖分析檢測方法的研究進(jìn)展

陳 輝*和嫻嫻**李浩然

（河北科技大學(xué)，石家莊 050018）

綜述植物多糖組分中糖醛酸和中性糖定性及定量的各種分析檢測方法，并進(jìn)行分類比較。

糖醛酸；中性糖；檢測方法；研究進(jìn)展

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，多糖組分檢測方法的研究日益受到重視。多糖是由10個以上的單糖，并通過糖苷鍵聚合而成的一種生物大分子，其相對分子質(zhì)量為數(shù)萬甚至數(shù)百萬。多糖一般分為均多糖和雜多糖，在天然多糖類中以雜多糖為主。在多糖組分結(jié)構(gòu)中除單糖外，還含有糖醛酸、去氧糖、氨基糖、糖醇等基團(tuán)。按照化學(xué)性質(zhì)，植物多糖可以分為中性多糖和酸性多糖。其中后者引入了糖醛酸等基團(tuán)而有酸性和一些相應(yīng)的藥效，通常有葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸。定量測定時，其中的糖醛酸與中性糖兩種組分會相互干擾而影響到實驗準(zhǔn)確性。由于植物多糖中組分性質(zhì)的不同，使組分的分析條件不同，增加了其分析測定的難度。

1 紫外分光光度法

分光光度測量是關(guān)于物質(zhì)分子對不同波長和特定波長處的輻射吸收程度的測量。按照顯色劑的不同，檢測糖醛酸的方法可以分為間羥基聯(lián)苯法和硫酸-咔唑法兩種。兩種具體方法的檢測步驟類似，均是加入四硼酸鈉硫酸溶液后，置于冰水浴中預(yù)冷。然后分別取空白溶液（蒸餾水）和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品各l mL加入到試管里，之后輕輕的震蕩，直至充分混勻，期間不斷用冰水浴冷卻，并將試管置沸水中加熱數(shù)分鐘，冷卻至室溫。最終加入顯色試劑，搖勻，并沸水中再加熱若干分鐘后，冷卻至室溫，在指定處測定吸光度，以吸光度對濃度作圖即可得出標(biāo)準(zhǔn)曲線。以上兩種方法的主要區(qū)別在于顯色試劑的種類和用量，分別加入的間羥基聯(lián)苯的氫氧化鈉溶液和咔唑的乙醇溶液，具體的顯色劑用量和衍生處理時間則是依照實驗過程而定。馬云翔等采用3，5-二甲方酚為顯色劑、參比波長為400 nm和測定波長為450 nm的測定方法，測定了不同豆類中非淀粉多糖中糖醛酸的含量，并且消除了中性單糖和木質(zhì)素等干擾，使糖醛酸測定的準(zhǔn)確度大大的提高。王遠(yuǎn)紅等運用硫酸-咔唑法測定梅花參多糖中糖醛酸的含量，結(jié)果精密度比較良好，并且硫酸-間羥聯(lián)苯法特異性更強。用以上兩種方法分析糖醛酸時，中性單糖也會產(chǎn)生一定的紫外吸收，會影響到糖醛酸的定量檢測的準(zhǔn)確性。

硫酸-咔唑法隨著雜質(zhì)性糖濃度的增大其吸收度也增大，說明中性糖與咔唑也發(fā)生反應(yīng)，因而這種方法檢測的糖醛酸含量測定結(jié)果偏離理論值較大；而在間羥基聯(lián)苯法中各濃度的中性糖溶液與間羥基聯(lián)苯并無交叉顏色反應(yīng)，故受雜質(zhì)中性糖的影響較小，檢測結(jié)果就比較接近理論值，此種方法測定糖醛酸的特異性較強。

2 紅外光譜法

紅外光譜法又稱紅外分光光度分析法，簡稱“IR”，是分子吸收光譜的一種。其利用物質(zhì)對紅外光區(qū)的電磁輻射的選擇性吸收來進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，是各種對紅外光有吸收的化合物的定性和定量分析方法。被測物質(zhì)的分子在紅外線照射下，只吸收與其分子振動、轉(zhuǎn)動頻率相一致的紅外光譜。在化合物分子中存在著許多原子團(tuán)，各個原子團(tuán)被激發(fā)后，均會產(chǎn)生特征振動，其振動頻率反映在紅外吸收光譜上。在紅外吸收光譜中，多糖的特征峰一般是3 500 cm-1處的羥基伸縮吸收峰和2 930 cm-1處的C-H伸縮振動吸收峰，而含有糖醛酸的樣品大多在1 700 cm-1～1 750 cm-1范圍內(nèi)會產(chǎn)生吸收，因此特征吸收峰可以作為驗證是否存在糖醛酸的定性依據(jù)，但是如果多糖中糖醛酸殘基含量比較少，那么特征吸收峰就有可能會被掩蓋，不能定性。在實驗室中，這種方法用于驗證多糖高級結(jié)構(gòu)中糖醛酸的存在性。

3 色譜分析法

在植物多糖中，與糖醛酸相鄰的糖單位間的糖苷鍵很難酸解，并且糖醛酸被釋放出來后容易發(fā)生內(nèi)酯化，所以對糖醛酸的分析檢測比較困難。常見的糖醛酸的檢測方法包括紙層析色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法和液相色譜法，其中以液相色譜法的運用較多。

3.1 紙層析色譜法

植物多糖組成分析中，紙色譜法屬于傳統(tǒng)方法之一。紙層析色譜法：取含量約30 μg～40 μg的單糖混合物樣品溶于水中，配成質(zhì)量濃度1%的溶液，并用微量吸管點樣2 μL～5 μL，以葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸為參比，采用合適的展開劑和特異顯色劑顯色，與已知糖的斑點顏色及Rf值進(jìn)行比對。其中硝酸銀、聯(lián)苯胺、苯胺-鄰苯二甲酸等都可以用于糖醛酸的顯色。如果色譜中葡萄糖醛酸有時出現(xiàn)兩個斑點，那么其中一個是由其內(nèi)酯存在引起的。張惟杰運用紙色譜法對糖醛酸進(jìn)行過初步的定性分析。

3.2 薄層色譜法

在糖醛酸分析原理上，薄層色譜法和紙層色譜法基本相同。方一泓等將水解濃縮的糖樣品用GF254板進(jìn)行層析，以正丁醇-吡啶-冰醋酸-水（體積比為6∶4∶1∶3） 為展開劑，苯胺-丙二溶液為顯色劑，分離的目標(biāo)組分中乳糖、鼠李糖和半乳糖醛酸三者的相對Rf值之比為1.0∶2.56∶0.69。這種方法能判定糖醛酸，而且適用于對多糖組分的初步分離確認(rèn)，有操作簡單和成本低的特點。

3.3 氣相色譜法

采用氣相色譜法分析多糖的組分時，由于糖類物質(zhì)結(jié)構(gòu)中含有極性基團(tuán)，并且極性基團(tuán)的內(nèi)氫鍵作用使分子內(nèi)部的吸引力增強，會導(dǎo)致樣品難以氣化，要先將單糖制成相應(yīng)的低沸點衍生物，一般采用糖腈乙酸酯衍生化法。李波等利用碳化二亞胺和硼氫化鈉還原多糖樣品中的糖醛酸為其相應(yīng)的中性單糖，最后通過GC分析前后中性單糖含量的變化推算出糖醛酸的組成。吳昌賢等先將樣品中的糖醛酸內(nèi)酯轉(zhuǎn)化為糖醛酸，用陰離子交換樹脂將糖醛酸的還原產(chǎn)物糖醇酸與糖的還原產(chǎn)物糖醇分開，將糖醇酸內(nèi)酯化后再進(jìn)行三甲基硅醚衍生化，最后用GC分析。Nishide將糖醛酸內(nèi)酯轉(zhuǎn)化成糖醛酸后，直接用離子交換樹脂將糖醛酸與中性糖分離，并進(jìn)行三甲基硅醚衍生化后再用GC分析。

GC的應(yīng)用可以準(zhǔn)確定量多糖組分中各種中性單糖，但是糖醛酸需經(jīng)還原后再衍生化，才能用此法檢測，使操作煩瑣和誤差較大。

3.4 液相色譜法

液相色譜法的衍生試劑檢測法和不加衍生試劑檢測法。其中較多的衍生試劑檢測法是PMP（即：1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）衍生法，由于生成的葡萄糖醛酸在水中并不穩(wěn)定，會生成葡萄糖醛酸內(nèi)酯并與之產(chǎn)生平衡，該方法采用堿性條件下加入PMP衍生，衍生后產(chǎn)生的衍生物能夠產(chǎn)生強紫外吸收，可以用紫外檢測儀檢測。但是這種方法針對性強，柱前的衍生化處理也會給定量分析帶來一定程度的誤差。高效液相色譜法檢測糖醛酸時常用到不加衍生試劑檢測的方法，即將葡萄糖醛酸樣品稀釋到一定程度后，選擇適當(dāng)?shù)纳V柱和流動相將樣品中各組分分離，再用紫外或示差折光檢測儀直接檢測分析。Strydomn用不加衍生試劑檢測的方法分析酸性、堿性和中性醛糖，成功分離15種單糖。饒金華等采用反向HPLC，在250 nm波長處進(jìn)行紫外檢測，測定出淫羊藿多糖由6種單糖組成，這些單糖組分實現(xiàn)了良好的分離，并具有良好的峰形。徐瑾等比較梯度和等度洗脫模式分析得到5種單糖獲得相似的分離效果。由此得出液相色譜方法的優(yōu)點在于簡單快捷、針對性好以及準(zhǔn)確性高。

4 高效毛細(xì)管電泳法

高效毛細(xì)管電泳法（HPCE）是一種在高壓電場中，根據(jù)帶電粒子的遷移速率不同而進(jìn)行分離的新技術(shù)，但由于糖類物質(zhì)不帶電，并且無熒光基團(tuán)或紫外吸收，故需先使糖帶電并具特征基團(tuán)，分離測定才能進(jìn)行。目前大多數(shù)植物多糖的單糖組分研究采用這種方法。趙燕等用硫酸液將多糖樣品水解成單糖，用PMP衍生化后對南瓜多糖進(jìn)行了單糖組成測定和質(zhì)量控制，流動相緩沖液選擇硼砂水溶液（150 mmol/L，pH10.8）；應(yīng)用CZE成功測定了唐古特大黃多糖中6種中性糖和2種糖醛酸（葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸） 組分。該法具有快速、簡單、進(jìn)樣量小、異構(gòu)峰少等優(yōu)點，還可用于分析其他多糖類藥物。

5 結(jié) 論

目前在實驗室檢測中，常用于多糖結(jié)構(gòu)中糖醛酸的初步鑒定的是紙色譜法和薄層色譜法，這兩種方法操作快捷且成本低。一般采用硫酸-咔唑法和硫酸-間羥聯(lián)苯法這兩種經(jīng)典的方法，以葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸的含量來計算，能很容易測定糖醛酸的總量，但是測定值并不能反映樣品中不同糖醛酸實際的含量。氣相色譜法雖然所用樣品量少和分辨率高，但需對糖和糖醇進(jìn)行衍生化處理，會導(dǎo)致實驗操作相對煩瑣以及測定時影響因素較多，造成相對較差的重現(xiàn)性。采用HPLC分析糖類物質(zhì)時不存在揮發(fā)性限制的問題，并且其多種分離模式可滿足大多不同性質(zhì)糖的分離分析，綜合來看已經(jīng)成為目前糖類物質(zhì)分析的最主要方法。在實驗室條件下，采用液相色譜法可用紫外檢測器和C18柱分離分析多糖中單糖的組成，對色譜柱的特異性要求同時也降低了，因此更具普遍性和適用性。液相色譜法與質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）可以對多糖組分進(jìn)行準(zhǔn)確定量定性，從而減小了檢測器的非選擇特征造成的誤差，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

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Research progress on analytical method for uronic acid and neutral sugar in plant polysaccharidesand

CHENhui*HE xian-xian**LI hao-ran
（Hebei universityofscience and technology，Shijiazhuang 050018，China）

This paper reviews various of analytical methods for uronic acid and neutral sugar in plant polysaccharides，and the classification comparison was conducted.

uronic acid；neutral sugar；analytical method；research progress

TS236.2

A

1673-6004（2011）02-0050-04

* 陳輝，男，1985年出生，1982年畢業(yè)于河北大學(xué)微生物與生化專業(yè)，學(xué)士，教授。

** 和嫻嫻，通訊作者，Email：hexian 1988123@126.com

2011-03-08