鈣結(jié)合蛋白 S100A8和 S100A9的異源二聚體體外構(gòu)建

秦鳳金，段曉華，殷紅梅，盛 梅，丁雪濤

(勝利油田中心醫(yī)院，山東東營(yíng) 257000)

S100A8和 S100A9是鈣結(jié)合蛋白 S100家族的兩個(gè)成員，最早發(fā)現(xiàn)由中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等表達(dá)，具有化學(xué)趨化作用，參與炎癥反應(yīng)過(guò)程，是多種炎性疾病的標(biāo)志物[1]。最近研究表明 S100A8和S100A9可以促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡，與乳腺癌、結(jié)腸癌、食管癌等腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移有關(guān)[2]，但目前對(duì)其發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡作用的機(jī)制尚不明確。2006～2007年，我們于體外構(gòu)建了 S100A8和 S100A9蛋白的異源二聚體(S100A8/S100A9)，旨在進(jìn)一步從細(xì)胞水平研究其生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 基因 S100A8和 S100A9的原核表達(dá)載體 pET28a-S100A8和 pET28a-S100A9由加拿大LAVAL大學(xué)醫(yī)學(xué)部感染性疾病研究中心饋贈(zèng)，高純度質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自德國(guó) Qiagen公司，抗S100A8抗體 Calgranulin B(C-19)、抗 S100A9抗體Calgranulin A(C-19)及抗 S100A8/S100A9抗體Calgranulin A/B(27E10)均購(gòu)自 Santa Cruz Biotechnology公司，Ni-NTA His Bind Resin購(gòu)自德國(guó) Novagen公司，IPTG購(gòu)自美國(guó) Sigma公司，BL21購(gòu)自北京 TIANGEN公司。

1.2 S100A8/S100A9構(gòu)建

1.2.1 S100A8和 S100A9蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將原核表達(dá)載體 pET28a-S100A8和 p ET28a-S100A9分別轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌 BL21，培養(yǎng)過(guò)夜，挑取分隔良好的單個(gè)菌落，用 5 ml LB細(xì)菌培養(yǎng)基，加入卡那霉素(終質(zhì)量濃度 50μg/ml)，37℃空氣浴搖床震搖過(guò)夜。第 2天取新?lián)u菌管，加入含同樣抗生素的 LB培養(yǎng)基 50 ml，將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液 1∶20稀釋，37℃空氣搖床震搖培養(yǎng) 2～3 h(220 r/min)，細(xì)菌達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(菌液 OD600=0.6～0.8)時(shí)開(kāi)始用 1 mM IPTG誘導(dǎo)，分成三部分，分別于 16、30、37℃空氣浴搖床震搖，優(yōu)化最佳培養(yǎng)條件。按照最佳培養(yǎng)條件(16℃，誘導(dǎo)培養(yǎng) 16 h)，大規(guī)模誘導(dǎo)細(xì)菌表達(dá)后，取1 ml菌液，4 ℃、4 000 r/min離心 10 min，棄上清 ，40 μl預(yù)冷的細(xì)菌裂解液重懸，超聲裂解，于 0℃、12 000 r/min離心 30 s，取上清 40μl加入 40μl 2×SDS加樣緩沖液，沉淀部分加入1×SDS加樣緩沖液40μl，100℃煮沸 10 min。分別取 20μl進(jìn)行 SDSPAGE電泳分析目的蛋白，鑒定蛋白是否以可溶形式表達(dá)。

1.2.2 S100A8和 S100A9蛋白純化 收集菌體，加入裂解緩沖液，在冰浴中超聲裂菌，收集菌液，4℃，12 000 r/min離心 20 min取上清液，經(jīng) His親和層析柱純化，最后一次洗脫前加入 10 U Thrombin，收集流出液并進(jìn)行 SDS-PAGE電泳及 Western blot鑒定。將 100μl p-Aminobenzamidingagarose試劑加入純化的 S100A8和 S100A9中，旋轉(zhuǎn)反應(yīng) 20 min后離心，去除 thrombin，已純化蛋白透析分裝后冷凍干燥，放于 -80℃冰箱保存。

1.2.3 S100A8/S100A9鑒定 用含 1.3 mM鈣離子的 Hanks-Hepes液溶解蛋白，BCA法蛋白定量后，取等量的 S100A8、S100A9蛋白混合，室溫放置 30 min，分別加入還原及非還原型 5×loading buffer，經(jīng)SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍(lán)染色，將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，依次滴加羊抗 S100A8/S100A9異源二聚體抗體及其 HRP標(biāo)記的兔抗羊抗體，采用發(fā)光蛋白免疫印跡法進(jìn)行 Western blot顯示分析。

2 結(jié)果

SDS-PAGE分析示 S100A8和 S100A9蛋白在相對(duì)分子質(zhì)量分別約 17 kD和 14 kD處出現(xiàn)明顯的特異條帶，而未經(jīng)誘導(dǎo)的菌體則無(wú)此條帶出現(xiàn)，證明確實(shí)為目的蛋白帶。部分誘導(dǎo)蛋白存在于上清中，以可溶形式在大腸桿菌中表達(dá)。Ni-NTA-His親和層析純化蛋白，得到純度較高的目的蛋白。經(jīng) SDSPAGE電泳及考馬斯亮蘭染色檢測(cè)到非還原電泳條件下特異的 S100A8/S100A9的條帶，說(shuō)明 S100A8/S100A9構(gòu)建成功。

3 討論

S100蛋白家族是鈣結(jié)合蛋白家族中最大的亞類，能夠與鈣離子結(jié)合，通過(guò)鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要生物學(xué)作用。近幾年來(lái)關(guān)于 S100家族成員異常表達(dá)與腫瘤關(guān)系報(bào)道較多，隨著研究深入，發(fā)現(xiàn) S100家族的多個(gè)成員與多種腫瘤的惡性增殖、分化、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3，4]，而且 21個(gè)成員中有 15個(gè)成員均位于人染色人體 1q21區(qū)，該區(qū)段穩(wěn)定性差，可發(fā)生多種形式的染色體重排，與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切。S100A8/A9又名鈣衛(wèi)蛋白，在炎癥中表達(dá)上調(diào)，有作為趨化靶點(diǎn)的作用。目前關(guān)于炎癥與腫瘤發(fā)生間的關(guān)系逐漸受到關(guān)注，S100A8/S100A9既是一種炎性介質(zhì)，在腫瘤中又有促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的作用。我們的前期實(shí)驗(yàn)亦證明兩者在宮頸鱗癌組織中表達(dá)下調(diào)[5]。體外形成其異源二聚體對(duì)進(jìn)一步研究其功能及其對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響具有重要意義。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[6]，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化S100A8和 S100A9蛋白，且兩個(gè)蛋白均以可溶形式在大腸桿菌表達(dá)，本研究于天然條件下純化得到了目的蛋白，保持了蛋白的生物活性，并成功構(gòu)建了S100A8/S100A9。由于 S100A8/S100A9的相對(duì)分子質(zhì)量與 S100A9/A9同源二聚體的相對(duì)分子質(zhì)量接近，因此僅從 SDS-PAGE電泳無(wú)法明確該條帶是否為 S100A8/S100A9。為進(jìn)一步鑒定明確，我們采用蛋白免疫印跡法用抗 S100A8/S100A9的抗體孵育。結(jié)果示異源二聚體抗體對(duì)同源二聚體不能識(shí)別，因此 S100A8/S100A9抗體檢測(cè)到的在相對(duì)分子質(zhì)量 27 kD處出現(xiàn)的特異條帶應(yīng)為 S100A8/S100A9，說(shuō)明 S100A8和 S100A9經(jīng)上述處理后，可形成異源二聚體。為下一步研究 S100A8/S100A9的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

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