Akirin1基因在肌肉發(fā)生中的作用

汪海鵬,原雪瑩,倪 華

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

脊椎動物的肌纖維在胚胎期已經(jīng)形成, 出生后數(shù)目不再改變。肌肉生長主要依賴肌衛(wèi)星細胞的增殖分化而導(dǎo)致現(xiàn)有肌纖維長度和周徑的增加,而不再依賴肌細胞數(shù)目的增多即細胞的增生。研究肌肉分化的機制對于了解胚胎發(fā)育、細胞增殖與分化具有重要意義。已經(jīng)公認，脊椎動物生肌過程主要由生肌決定因子家族(MRFs)、心肌細胞增強子2家族(MEF2s)以及肌肉生成抑制素myostat in(MSTN)等調(diào)控。其中MRFs與MEF2s二者相互促進并維持其表達，在不同的發(fā)育階段促進肌肉分化。MRFs除了調(diào)控肌肉生成，還能夠誘導(dǎo)成纖維細胞、脂肪細胞等多種不同來源的細胞向肌肉方向分化。MSTN則作為肌肉生長的抑制子負調(diào)節(jié)肌肉發(fā)生。Aki r in1基因是近年來新發(fā)現(xiàn)的受MSTN特異性下調(diào)的靶基因?，F(xiàn)就國內(nèi)外對Aki r in1基因的定位與結(jié)構(gòu)、表達與調(diào)節(jié)、生物學(xué)功能等方面的研究進展綜述。

1 Akirin1基因結(jié)構(gòu)及定位

Marshal l等通過比較MSTN敲除的小鼠和野生型小鼠肌肉中mRNA的基因表達差異鑒定出MSTN下游的一個新基因mighty[1]。Goto等研究了果蠅和小鼠的Aki r ins，后統(tǒng)一將mighty命名為Akirin1[2]。Akirin1屬于Akir ins家族，該家族還含有Aki r in2。有研究表明，Aki r in2單核苷酸多態(tài)性影響牛肉大理石花紋的含量[3]。小鼠的Aki rin1定位于4D2.D，編碼2271 bp的mRNA，含有576 bp的ORF。牛的Aki rin1位于3號染色體，DNA長12 212 bp，mRNA長3 760 bp，含有578 bp的CDS，編碼193個AA。Akirin1在各個物種間相對保守，但并不與目前已知的任何蛋白具有較高的同源性[4,5]。Akirins含有一個保守的功能性結(jié)構(gòu)域即N末端的核定位信號NLS。Aki rin1蛋白在核中聚集成斑，核周圍和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也有分布。Akir in1與核纖層蛋白有著相同的定位，二者一起結(jié)合定位在DNA調(diào)節(jié)區(qū)域的基質(zhì)附著區(qū)(MARs)，這種結(jié)合可能是Aki rin1調(diào)節(jié)下游靶基因表達的基礎(chǔ)。Beut ler等證明，Akirin1能與DNA結(jié)合蛋白，或者染色質(zhì)重塑蛋白如HAT(組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶)相互作用從而啟動下游基因表達[6]。

2 Akirin1的表達模式

張志強等發(fā)現(xiàn)，Aki r in1在仔豬的18種組織中均有分布，且大部分表達水平較高，提示Aki r in1參與豬早期發(fā)育[7]。Marshal l等發(fā)現(xiàn)Akir in1在小鼠的多種組織中表達，肌肉中的表達相對低于其他組織，如腦、睪丸、肺、腎、腸和肝，表明Aki r in1在體內(nèi)有著廣泛的作用[1]。成體后的肌肉組織在受到損傷后能夠自我修復(fù)并重生，肌衛(wèi)星細胞(SC)的激活是肌肉重生的關(guān)鍵步驟。激活的SC進入細胞周期，然后自我更新或者分化形成肌管。qRT-PCR和Western blot顯示，激活的SC中Aki rin1表達水平比靜止的要高，這表明Aki r in1可能激活SC進而促進肌肉分化。在心臟毒素notexin注射模型和肌肉切割損傷模型的肌肉修復(fù)和重生過程中，Aki r in1的表達水平隨重生進程逐漸升高。這些表明，Akir in1的表達上調(diào)促進肌肉重生。Akirin1除了在肌肉組織中，還在炎癥細胞如巨噬細胞中表達。Salerno等在小鼠的腹膜和骨髓起源的巨噬細胞中都檢測到Akirin1的表達，表明Akirin1可能參與炎癥反應(yīng)[8]。

3 Akirin1基因的功能

3.1 Akirin1的過表達能夠促進肌肉分化與再生

Aki r in1在C2C12細胞中的過表達能夠?qū)е录毎芷诘奶崆巴顺?，肌肉分化?biāo)志性分子如p21，MyoD，MyoG和MyHC的表達增強，融合指數(shù)(肌管中細胞核占總細胞核的比例)較對照組顯著上升，最終形成肥大的肌管。在mdx小鼠(一種肌營養(yǎng)不良的小鼠模型)中過表達Akirin1可以增加肌纖維橫截面積，并形成短粗而肥厚的肌管。HE染色發(fā)現(xiàn)相對于野生型mdx小鼠，過表達Akirin1組的脛骨前肌的重量比對照組要重，并且有著更多的肥大的肌纖維，肌纖維形態(tài)更健康，也更容易鑒定[1]。另外，通過Van Geisen染色發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，Akirin1的過表達還降低了肌肉組織的纖維化，肌肉的退行得到了改善。這些結(jié)果提示，外源表達Akirin1能夠促進成肌細胞分化。

哺乳動物成體骨骼肌是一個動態(tài)的組織，循環(huán)發(fā)生著損傷和修復(fù)。肌肉損傷伴隨一系列的事件發(fā)生，如炎癥反應(yīng)、肌纖維重生、纖維化等。多種生長因子，如IGFs、FGFs、HGFs等參與該過程。肌肉重生時的表達分析表明，Akir in1早在肌肉重生的第2天就開始表達，并且隨著新生肌管的形成表達逐漸升高。這些提示，Aki rin1的表達與肌肉再生過程密切相關(guān)。

3.2 參與炎癥反應(yīng)并增強細胞的趨化遷移能力

肌肉重生包括兩個重要步驟：炎癥應(yīng)答后的細胞遷移、肌肉重生。在肌肉再生早期，損傷的肌肉能釋放炎癥因子向周圍的炎癥細胞，如中性白細胞、巨噬細胞等提供趨化信息，以濃度梯度誘導(dǎo)炎癥細胞向肌肉損傷處遷移。巨噬細胞主要分泌蛋白水解酶吞噬降解細胞碎片，并分泌炎癥因子以吸引成肌前體細胞遷移至受損位置。另外，還可以通過釋放肌肉再生因子調(diào)節(jié)肌肉再生。Sun等認為，Akirin1可能與染色質(zhì)結(jié)合來參與NF-κB調(diào)控的免疫反應(yīng)，Akirin1對果蠅S2細胞抵抗革蘭氏陰性菌侵染時產(chǎn)生抗菌肽是必須的[9]。Salerno等發(fā)現(xiàn)巨噬細胞也表達Akirin1，過表達Akirin1導(dǎo)致了巨噬細胞的遷移性增加，促使損傷部位的炎癥細胞發(fā)揮相應(yīng)功能。

哺乳動物胚胎期肌肉生成時成肌細胞也一直在遷移。成肌細胞不僅從體節(jié)遷移到肢端產(chǎn)生肌肉系統(tǒng)，在肌肉內(nèi)部也能夠遷移，彼此融合或者和現(xiàn)存的肌管融合[10]。C2C12以及過表達Akirin1的細胞在2%HS+5%CEE(最適化學(xué)引誘劑培養(yǎng)基)存在時有著相同的遷移能力。但CEE撤去時，對照組C2C12遷移數(shù)顯著減少，而Akirin1過表達細胞系則和CEE存在時遷移效果一樣，表明Akirin1的過表達增強了成肌細胞的趨化運動能力。成肌細胞遷移需要肌動蛋白actin的聚合，actin聚合形成板狀偽足和絲狀偽足以提供趨化運動的動力。Marshal l等認為，在成肌細胞中，Aki r in1通過重塑肌動蛋白細胞骨架，以PI3K依賴的方式形成更有效的板狀偽足，增強巨噬細胞與成肌細胞的趨化作用[1]。

4 Akirin1基因的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)

4.1 Akirin1在轉(zhuǎn)錄水平受到MSTN的負調(diào)節(jié)

Marshal l等發(fā)現(xiàn)，Aki r in1在小鼠肌肉中的表達相對低于其他組織，如腦、腸和肝等，但肌肉組織中的mRNA水平在MSTN敲除顯著上調(diào)，而其他組織中敲除前后未見明顯變化。對Akir in1基因啟動子活性研究發(fā)現(xiàn)，MSTN能以劑量依賴的方式抑制Akir in1啟動子的活性。而先經(jīng)MSTN處理，再向培養(yǎng)體系中添加MSTN的拮抗劑MSTN-ant1后，Akirin1啟動子活性逐漸恢復(fù)。這些結(jié)果表明，MSTN在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)Aki r in1基因的表達。MSTN的功能主要通過I型受體ALK5，II型受體ActRIIB和smad2/3這些受體實現(xiàn)。將Akirin1啟動子分別和dnActRIIB、dnALK5受體或者dnSmad2/3這些顯性負突變載體共轉(zhuǎn)染C2C12細胞，發(fā)現(xiàn)外源MSTN并不影響Aki rin1啟動子的活性。Akirin1依然能夠表達，證明MSTN對Akirin1的啟動子活性的調(diào)節(jié)通過這些下游受體實現(xiàn)[1]。Aki r in1在野生型和MSTN-nul l的小鼠肌肉損傷后的第5天開始上調(diào)，此時成肌細胞彼此融合形成新的肌管，或者和現(xiàn)有的肌管融合。隨后Akir in1在終末分化時一直下調(diào)，最終肌肉分化完成，SC細胞重新進入靜止期。Aki rin1的這種表達模式與其通過促進融合最終誘導(dǎo)肌管肥大的作用是一致的。同時也說明，在正常的肌肉組織中MSTN參與維持Aki rin1的正常表達，控制肌肉的正常形態(tài)。脂多糖處理巨噬細胞后，Akir in1的表達上升，而向培養(yǎng)體系添加重組MSTN蛋白則顯著下調(diào)其表達水平，MSTN的拮抗劑MSTN-ant1能夠解除MSTN對Aki rin1的抑制[1]。這些結(jié)果表明，Akir in1參與成肌細胞與巨噬細胞的激活并受到MSTN的下調(diào)。

4.2 Akirin1調(diào)節(jié)肌肉發(fā)生相關(guān)基因的表達

以前認為，MSTN能夠抑制MyoD的表達和活性，控制成肌細胞的增殖速率從而抑制骨骼肌的肥大。MSTN激活smad3信號通路，激活的smad3結(jié)合到MyoD啟動子上并抑制MyoD的轉(zhuǎn)錄進而抑制肌肉分化。除了影響胚胎肌肉發(fā)生，MSTN也影響出生后的肌肉發(fā)生。最近的研究表明，MSTN和衛(wèi)星細胞的靜止有關(guān)，MSTN缺失后會增加衛(wèi)星細胞的激活并促進肌肉恢復(fù)。Akirin1基因?qū)STN的缺失和成肌細胞分化的增強這二者聯(lián)系起來。

4.2.1 Akirin1促進MRFs的表達

在C2C12分化過程中，Akirin1的表達峰值出現(xiàn)時間遠早于MyoD，表明Akirin1作用于MyoD的上游。Aki r in1能夠特異性地上調(diào)細胞周期調(diào)節(jié)子如p21和p27，并促進p21、MyoD、MyoG以及MHC的表達，過表達Akirin1的細胞系比對照組更早地退出細胞周期。成熟的肌管能夠表達MHC，并具有多個細胞核，過表達Akirin1使得肌管出現(xiàn)的時間提前，說明Akirin1在肌管融合時的表達與肌肉分化密切相關(guān)。MSTN缺失形成的雙肌牛的成肌細胞經(jīng)誘導(dǎo)形成的肌纖維(DM)比野生型牛成肌細胞形成的肌纖維(NM)表達更高水平的Akirin1，與之相應(yīng)的是p21、MyoD和MyoG表達水平的升高，其中以p21和MyoD的上升幅度最高，二者的表達峰值在DM中比NM要早。通過RNAi降低Akirin1在C2C12細胞中的表達水平之后MyoD的表達水平也下降，p21和MyoG的表達也隨之降低，表明Aki r in1的降低導(dǎo)致了這些肌肉分化標(biāo)志性分子的下調(diào)，從而減緩了肌肉分化的進程[1]。這些結(jié)果說明，Akirin1通過上調(diào)MRFs促進肌肉分化。

4.2.2 過表達Akirin1降低了Sca-1與CD34的表達水平

C2C12細胞或成肌細胞分化培養(yǎng)時，仍然有一部分細胞保持靜止，但是能夠自我更新和分化，這部分細胞稱為保留細胞。分子和免疫組化研究顯示，低水平的Aki r in1和靜止的SC相關(guān)，而激活的SC則有著高水平的Akir in1表達。Aki r in1能招募更多激活的SC進入分化途徑，過表達Akirin1的C2C12細胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后殘留的SC數(shù)量減少，從而形成比正常肥大的肌管。

靜止的保留細胞能夠表達SC的標(biāo)志性分子Sca-1(干細胞抗原)和CD34，啟動分化后二者蛋白水平開始下降。Epting等認為，Sca-1的表達能夠保持成肌細胞處于緩慢增殖且不分化的狀態(tài)以產(chǎn)生保留細胞。Sca-1在肌管中的表達水平低于保留細胞，并且過表達Aki rin1的細胞系中Sca-1的表達水平整體上低于在C2C12對照組，其中肌管中降低了60%～70%，靜止細胞中降低了40%～50%。另外，通過BrdU標(biāo)記細胞發(fā)現(xiàn)，過表達Akir in1的細胞在分化培養(yǎng)時，BrdU陽性細胞立即顯著減少，Akirin1下調(diào)Sca-1導(dǎo)致細胞增殖和融合加速，從而促進肌肉分化[11]。

CD34在肌肉中的作用可能是維持一部分細胞不進行分化。Kitzmann等證實了該觀點，保留細胞對CD34的表達是異質(zhì)的[11]。無論處于增殖狀態(tài)還是誘導(dǎo)分化，Aki rin1過表達的細胞中CD34的總體水平一直低于對照組。Akirin1下調(diào)CD34使得一部分細胞對融合和分化信號更為敏感，更容易啟動分化。這表明Akirin1可能通過下調(diào)Sca-1和CD34這兩個干細胞維持分子有效地促使細胞快速退出細胞周期。

5 結(jié)語

哺乳動物的肌肉發(fā)生一直受到廣泛關(guān)注，相關(guān)的研究主要集中在肌纖維形成和肌肉重生的分子機制上。目前認為，肌肉發(fā)生主要受到MRFs、MEF2s、MSTN等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。其中MSTN在肌肉分化中負調(diào)控肌纖維的數(shù)量和體積以維持正常機體發(fā)育所需。Aki r in1作為新發(fā)現(xiàn)的MSTN下游基因，由于能夠顯著促進肌肉分化和重生而受到重視，但是其作用機制尚未完全闡明。未來的研究主要集中于進一步弄清Akir in1的表達模式及是否存在自我調(diào)節(jié)，Aki r in1在不同細胞中的作用，Akirin1與生長因子之間的關(guān)系，Akirin1上下游的轉(zhuǎn)錄因子以及相互作用機制這些方面。深入研究Aki rin1不僅可以更加透徹地了解肌細胞生長分化及肌肉形成的分子機制，也可以為臨床上肌肉相關(guān)疾病的治療提供理論依據(jù)。研究Aki r in1的作用和調(diào)控機制也能為轉(zhuǎn)基因動物和分子育種提供理論基礎(chǔ)，為生產(chǎn)上提高動物的產(chǎn)肉量提供分子育種的新標(biāo)記。

[1] Marshal l A,Salerno MS,Thomas M,et al.Mighty is a novel promyogenic factor in skeletal myogenesis.Expcell Res,2008,314(5):1013-1029.

[2] Goto A, Matsushita K, Gesel lchen V,et al.Akirins are highly conserved nuclear proteins, required for NF-κB dependent gene expression in Drosophila and mice.Nat Immunol,2008, 9(1):97-104.

[3] Sasaki S,Yamada T,Sukegawa S,et al.Association of a single nucleotide polymorphism in akirin 2 gene with marbling in Japanese Black beefcattle.BMC Res Notes.2009,2:131-135.

[4] Macqueen DJ, Johnston IA.Evolution of the multifaceted eukaryotic Akiringene family.BMC Evol Biol,2009,9:34.

[5] 黃锎靚,王繼文,李亮.一個新的促成肌因子:Mighty.中國家禽科學(xué)研究進展,374-377.

[6] Beut ler B, Moresco EM.Akirins versus infection.Nat Immunol,2008,9(1):7-9.

[7] 張志強,李宏基,王偉杰.豬Mighty基因的克隆與組織表達分析.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2009,21(2):1-4.

[8] Salerno MS, Dyer K, Bracegirdle J,et al.Akirin1(Mighty), a novel promyogenic factor regulates musc le regeneration and cell chemotaxis.Expcell Res, 2009,315(12):2012-2021.

[9] Sun SC, Ley SC.New insights into NF-kB regulation and function.Trends Immunol, 2008,29(10):469-478.

[10] Pajcini KV, Pomerantz JH, Al kan O,et al.Myoblasts and mac rophages share molecular components that contribute to cell–cell fusion.J cell Biol, 2008,180(5):1005-1019.

[11] Dyer,Kelly A.Characterisation of mighty expression during skeletal muscle regeneration.University of Waikato,2006.