銅綠假單胞菌碳青霉烯類抗生素耐藥機(jī)制研究

摘要：目的 探究杭州某醫(yī)院銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制。方法 采用紙片擴(kuò)散法對(duì)耐藥菌株進(jìn)行篩選;抗生素的最低抑菌濃度（MIC）用瓊脂稀釋法檢測(cè);PCR擴(kuò)增碳青霉烯酶基因（blaKPC-2、blaMCR-1、blaIMP-1、blaIMP-2、blaVIM-1、blaVIM-2）;用MLST對(duì)銅綠假單胞菌進(jìn)行ST分型。結(jié)果 78株對(duì)亞胺培南耐藥的銅綠假單胞菌中發(fā)現(xiàn)24株含KPC-2型碳青霉烯酶，MLST結(jié)果顯示，21株（87.5%）為ST463，2株（8.3%）為ST1076，1株（4.2%）為ST244。結(jié)論 KPC-2酶已成為杭州某醫(yī)院銅綠假單胞菌碳青霉烯類抗生素耐藥重要原因之一，ST463是該院產(chǎn)KPC-2酶銅綠假單胞菌主要ST型別。

關(guān)鍵詞：碳青霉烯酶;銅綠假單胞菌;KPC-2

【中圖分類號(hào)】R453.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1673-9026（2021）08-019-02

上世紀(jì)70年代后期研發(fā)出的碳青霉烯類抗生素是該時(shí)期抗菌譜最廣、抗菌活性最強(qiáng)的非典型β-內(nèi)酰胺類抗生素，被認(rèn)為是抗生素的最后一道防線[1]。碳青霉烯類抗生素主要通過抑制青霉素結(jié)合蛋白從而抑制參與細(xì)菌細(xì)胞壁黏肽合成的內(nèi)肽酶和糖苷酶的合成，使細(xì)菌的細(xì)胞壁破損，致細(xì)菌膨脹、溶解、失活，從而達(dá)到滅菌效果。近年來，由于臨床廣譜抗生素的大量使用，銅綠假單胞菌（PAE）對(duì)各類抗生素的耐藥性均逐年升高，對(duì)醫(yī)院的院內(nèi)感染防控和臨床的抗感染治療造成巨大的挑戰(zhàn)。

目前，人們發(fā)現(xiàn)CRPA的耐藥機(jī)制主要有：（1）主動(dòng)外排系統(tǒng)過表達(dá);（2）產(chǎn)生碳青霉烯水解酶;（3）外膜蛋白OprD2的缺失或突變等。除上述耐藥機(jī)制外，銅綠假單胞菌新的耐藥機(jī)制還在不斷地產(chǎn)生。如2013年，中國(guó)在世界上首次報(bào)道從泛耐藥銅綠假單胞菌中查出KPC型β-內(nèi)酰胺酶基因[2]。肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）主要存在于腸桿菌科細(xì)菌內(nèi)，是近些年來人們重點(diǎn)關(guān)注的碳青霉烯酶之一，其不僅可以水解所有β-內(nèi)酰胺類抗生素，包括碳青霉烯類抗生素，而且阿莫西林/克拉維酸（AMC）也不能完全將其滅活[3]。

在PAE對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥機(jī)制的研究中，關(guān)于KPC等非金屬酶的報(bào)道相對(duì)于金屬酶型碳青霉烯酶，目前依然較少，但種種報(bào)道表明這些非金屬酶導(dǎo)致的耐藥機(jī)制在逐漸由腸桿菌往非發(fā)酵菌擴(kuò)散 [2、4]。此次研究對(duì)從該醫(yī)院住院患者標(biāo)本中分離出的78株CRPA進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)KPC-2已經(jīng)成為該院銅綠假單胞菌流行較廣的碳青霉烯酶之一，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 從2018年7月至2019年7月杭州某醫(yī)院兩院區(qū)住院患者的各類標(biāo)本中分離出78株對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的銅綠假單胞菌，采用全自動(dòng)微生物鑒定儀（Vitek 2 Compact）鑒定細(xì)菌到種。K-B紙片法驗(yàn)證菌株對(duì)碳青霉烯類抗生素的敏感性。

1.2 主要儀器和試劑 主要儀器設(shè)備：全自動(dòng)微生物鑒定儀Vitek-2 Compact、比濁儀Vitek Densichek（法國(guó)BioMérieux公司）;PCR擴(kuò)增儀（德國(guó)Biometra公司）;VITEK MS質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)（法國(guó)生物梅里埃公司）;Powerpac基礎(chǔ)電泳儀（美國(guó)BIO-RAD公司）。主要試劑：M-H瓊脂干粉、哥倫比亞基礎(chǔ)瓊脂干粉（英國(guó)Oxoid公司）;中國(guó)藍(lán)玫瑰酸瓊脂（杭州天和微生物試劑有限公司）;VITEK GP和GN鑒定卡（法國(guó)BioMérieux公司）;核酸電泳瓊脂糖（西班牙Biowest公司）;VITEK MS配套試劑：α-氰4-羥基苯丙烯酸（HCCA）、三氟乙酸（TFA）、無水乙醇、甲酸、色譜純乙腈（美國(guó)Sigma公司）;PCR反應(yīng)試劑盒、DNA Marker DL20，00、DL5，000、DL15，000（日本Takara公司）。

1.3 細(xì)菌的鑒定 用Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀和VITEK MS質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)對(duì)住院患者中分離的CRPA進(jìn)行重新鑒定。（參照相應(yīng)儀器的說明進(jìn)行Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀和VITEK MS的操作）

1.4 PCR擴(kuò)增耐藥基因和序列分析 PCR擴(kuò)增碳青霉烯酶基因（blaKPC-2、blaMCR-1、blaIMP-1、blaIMP-2、blaVIM-1、blaVIM-2）。耐藥基因引物相關(guān)信息見表1。用堿裂解法提取細(xì)菌質(zhì)粒DNA作為模板。PCR反應(yīng)體系：5μl 10×Buffer 緩沖液，3μl dNTP，0.25μl Taq DNA聚合酶，3μl DNA模板，上下游引物各1μl，用無菌純水補(bǔ)足到50μl。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，1個(gè)循環(huán);94℃變性1min，退火1min（退火溫度根據(jù)不同引物而定），72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸7min，1個(gè)循環(huán)。用1%瓊脂糖凝膠對(duì)耐藥基因進(jìn)行恒壓電泳，電壓：100V，時(shí)間：25min，最后在紫外燈下觀察結(jié)果。

1.5 多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST） PCR擴(kuò)增銅綠假單胞菌7對(duì)管家基因（acsA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA、trpE）。引物序列、TM、擴(kuò)增長(zhǎng)度見表2。具體操作方法：提取細(xì)菌基因組DNA作為模板，PCR反應(yīng)體系：5μl 10×Buffer 緩沖液，3μl dNTP，0.25μl Taq DNA聚合酶，3μl DNA模板，上下游引物各1μl，用無菌純水補(bǔ)足到50μl。PCR反應(yīng)條件同上，紫外燈下觀察結(jié)果。將獲得的PCR產(chǎn)物純化后送上海生工公司測(cè)序，將序列結(jié)果提交到數(shù)據(jù)庫https：//pubmlst.org/paeruginosa/info/primers.shtml進(jìn)行在線序列比對(duì)，最終確定菌株的MLST型別。

2 結(jié)果

2.1 菌株收集情況 2018年7月至2019年7月，從該醫(yī)院兩院區(qū)住院患者標(biāo)本中分離得到碳青霉烯類抗生素耐藥銅綠假單胞菌78株，其中69株分離自老院區(qū)，9株分離自新院區(qū)。其中65.4%（51/78）的菌株分離自ICU病房。痰液是此次研究中耐藥菌株的主要來源，60.3%（47/78）菌株來自痰液，19.2%（15/78）菌株來自尿液，20.5%（16/78）菌株來自其他標(biāo)本（糞便、膿液、膽汁、全血等）。

2.2 菌株耐藥基因檢測(cè)情況 通過耐藥基因檢測(cè)，78株碳青霉烯類抗生素耐藥的銅綠假單胞菌中有24株為KPC-2陽性（表3）。

2.3 藥物敏感性試驗(yàn) 采用瓊脂稀釋法檢測(cè)24株KPC-2陽性銅綠假單胞菌對(duì)臨床上常用的頭孢類、碳青霉烯類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類等抗生素的藥物敏感性，根據(jù)銅綠假單胞菌藥敏試驗(yàn)解釋標(biāo)準(zhǔn)判斷菌株的藥物敏感性。檢測(cè)結(jié)果為：24株菌株全部都對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥，多數(shù)菌株（≥75%）對(duì)頭孢類抗生素（頭孢曲松，頭孢吡肟）、氨曲南、替加環(huán)素耐藥;少數(shù)菌株（≤25%）對(duì)氨基糖苷類（慶大霉素，阿米卡星，妥布霉素）耐藥;另有70.8%（17/24）菌株對(duì)左旋氧氟沙星耐藥，62.5%（15/24）對(duì)環(huán)丙沙星耐藥。

2.4 多位點(diǎn)序列分析 利用已知的7對(duì)管家基因?qū)?4株CRPA進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型，分型結(jié)果見表4。ST463為主要分型，高達(dá)87.5%，只有個(gè)別菌株為ST1076和ST244型。

3.分析和討論

銅綠假單胞菌是醫(yī)院感染的主要病菌之一，免疫力低下的患者常常容易被感染。并且多重耐藥菌株的陽性率也呈逐年上升的趨勢(shì)，在該醫(yī)院也形成了廣泛的流行，甚至出現(xiàn)了泛耐藥菌株，其對(duì)碳青霉烯類、氨基糖苷類、頭孢類和氟喹諾酮類等臨床常用抗生素均耐藥，這給醫(yī)院的臨床治療帶來極大挑戰(zhàn)[5]。

近些年來，對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的PAE在全球范圍內(nèi)大流行，國(guó)外對(duì)耐藥菌株的報(bào)道也日益增多[6]。研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌中碳青霉烯酶類型大不相同，據(jù)國(guó)外報(bào)道顯示，其銅綠假單胞菌所產(chǎn)的碳青霉烯酶主要以VIM為主，且有多種亞型，另外IMP型也較多見[7、8]。而本次對(duì)該醫(yī)院的78株銅綠假單胞菌耐藥基因的檢測(cè)顯示30.8%（24/78）的菌株為KPC-2型，未見VIM和IMP型耐藥菌株。

在世界范圍內(nèi)，銅綠假單胞菌的多位點(diǎn)序列分型（MLST）較多的是ST235，ST244，ST357等[9]。德國(guó)有過報(bào)道產(chǎn)KPC-2的銅綠假單胞菌為ST235[10]，且ST235曾在世紀(jì)范圍大流行，西班牙、韓國(guó)等地都有過爆發(fā)[11-12]。另外2018年在巴西發(fā)現(xiàn)了新的產(chǎn)KPC-2銅綠假單胞菌分型：ST2584[13]。而本次實(shí)驗(yàn)的24株KPC-2陽性銅綠假單胞菌菌株的多位點(diǎn)序列分型結(jié)果顯示ST463型菌株高達(dá)87.5%，為主要分型，不同于其他國(guó)家，提示國(guó)內(nèi)流行有其特異性。

2007年杭州的浙一醫(yī)院首次報(bào)道了我國(guó)產(chǎn)KPC-2酶肺炎克雷伯菌[14]，隨后在2011國(guó)內(nèi)出現(xiàn)首例產(chǎn)KPC-2酶銅綠假單胞菌[15]。2015年有研究證實(shí)肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌攜帶的KPC-2型碳青霉烯酶的編碼基因位于質(zhì)粒上，并確定碳青霉烯類抗生素的耐藥性能夠伴同質(zhì)粒在不同菌種間傳播[16]。結(jié)合本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，高達(dá)87.5%的ST463型菌株攜帶者多為ICU病房住院患者，提示克隆傳播的可能性極大，這對(duì)住院患者的臨床治療帶來巨大的挑戰(zhàn)，且必須對(duì)產(chǎn)KPC-2銅綠假單胞菌株加以預(yù)防和控制，防止其進(jìn)一步流行播散。

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作者簡(jiǎn)介：何勝兵（1997-04）男，漢族，安徽省滁州市，杭州市兒童醫(yī)院，技師，本科，理學(xué)學(xué)士學(xué)位，細(xì)菌耐藥性