噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)應(yīng)用研究進(jìn)展

蔡家利，孫加燕，扈國(guó)達(dá)，王 亮，丁 森，劉 勇

(重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054)

單克隆抗體由于高特異性和高親和性，在疾病的預(yù)防、診斷和治療發(fā)面發(fā)揮著重要作用，是后基因組時(shí)代重要的生物學(xué)工具［1－2］。它是一種將PCR技術(shù)和噬菌體展示技術(shù)相結(jié)合，在噬菌體表面表達(dá)、分泌，經(jīng)篩選后獲得特異性抗體的技術(shù)。噬菌體展示技術(shù)由Smith［3］首次闡述，基本原理是將目的基因克隆到噬菌體的外殼蛋白基因組中，轉(zhuǎn)染大腸桿菌，使目的基因與外殼蛋白以融合蛋白的形式表達(dá)，呈現(xiàn)在噬菌體表面，通過固相親和篩選，富集到表達(dá)目的分子的噬菌體。噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)就是該技術(shù)的一項(xiàng)成功應(yīng)用。第1例噬菌體抗體庫(kù)由Mccafferty［4］等在1990年構(gòu)建。該技術(shù)的出現(xiàn)開創(chuàng)了一條簡(jiǎn)捷的基因工程抗體生產(chǎn)路線，并在許多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，已顯示出強(qiáng)大的生命力。

1 噬菌體抗體庫(kù)概述

1.1 噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建

用B淋巴細(xì)胞全套抗體可變區(qū)基因克隆并組裝成的噬菌體變異群體稱為噬菌體抗體庫(kù)［5］?？贵w庫(kù)構(gòu)建的一般過程:① 從可變區(qū)基因來(lái)源中分離RNA。②互補(bǔ)DNA第1條鏈的合成。③構(gòu)建可變區(qū)基因的PCR和可變區(qū)基因文庫(kù)。④ 進(jìn)行載體和可變區(qū)基因文庫(kù)的限制性消化和連接。⑤感染大腸桿菌并表達(dá)目的基因。⑥篩選抗體。

1.2 噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)載體

噬菌體文庫(kù)所用的載體通常是絲狀噬菌體和噬菌粒［6］。絲狀噬菌體載體一般所用的是外殼蛋白g3p與g8p展示系統(tǒng)。但也有一些學(xué)者利用其他的外殼蛋白，例如 Gao［7］等利用 g9p展示scFv，經(jīng)過第1輪篩選就得到了 4.5×109個(gè)不同的scFv抗體。但是噬菌體載體通常為多價(jià)展示，容易產(chǎn)生螯合效應(yīng)和親和效應(yīng)，導(dǎo)致多樣化的結(jié)合效果。噬菌粒載體是一種將融合蛋白基因克隆到一個(gè)被一弱啟動(dòng)子調(diào)控的小質(zhì)粒中的載體。噬菌粒作為載體時(shí)，需要輔助噬菌體提供野生型噬菌體蛋白，從而使噬菌粒進(jìn)行正常的包裝。輔助噬菌體的選擇和優(yōu)化對(duì)于抗體庫(kù)非常重要，選擇不當(dāng)會(huì)影響篩選效率［8］。Mi－young Oh 等［9］用琥珀終止密碼子UAG替代輔助噬菌體M13KO7 g3p基因組中5’端的第1和第2個(gè)密碼子GAA，從而構(gòu)建了輔助噬菌體Ex12。將M13KO7和Ex12分別感染含有噬菌粒PCMTG－SP112Fab(抗丙酮酸脫氫酶 Fab抗體片段)的抑制性菌株 XL－Blue MRF’，結(jié)果表明Ex12的展示水平提高了50倍，親和性提高了100倍。

1.3 抗體庫(kù)的種類

一般可分為免疫抗體庫(kù)和非免疫抗體庫(kù)。免疫抗體庫(kù)是采用免疫后淋巴細(xì)胞的V基因構(gòu)建的文庫(kù)，親和性高，多樣性差。Michael D.Gunn 等［10］通過篩選抗hTLR2的抗體庫(kù)，發(fā)現(xiàn)該抗體庫(kù)可以產(chǎn)生抗鼠源TLR2抗hTLR5、抗hTLR6抗體，并且對(duì)hTLR2均無(wú)交叉反應(yīng)，證明某抗體庫(kù)如果能產(chǎn)生針對(duì)某蛋白家族中的一種抗體，則也有可能產(chǎn)生針對(duì)該家族的其他成分抗體，這有助于增加免疫抗體庫(kù)的多樣性。非免疫抗體庫(kù)又包括天然抗體庫(kù)、半合成抗體庫(kù)和合成抗體庫(kù)。天然抗體庫(kù)基因來(lái)源于未經(jīng)免疫的供體。半合成抗體庫(kù)是指人工合成CDR3部分，再與可變區(qū)基因組合構(gòu)建的抗體庫(kù)。全合成抗體庫(kù)即人工合成全部可變區(qū)基因構(gòu)建的抗體庫(kù)。

根據(jù)抗體基因動(dòng)物來(lái)源可分為鼠源抗體庫(kù)、人源抗體庫(kù)、兔源抗體庫(kù)、駝源抗體庫(kù)等。治療性抗體的臨床前研究通常得益于鼠源抗體庫(kù)的開發(fā)，但是僅用于分離 mAbs的鼠源抗體庫(kù)［11－12］則很少報(bào)道。R.Sommavilla［13］等突變抗體可變區(qū)的CDR3部分構(gòu)建了3個(gè)鼠源scFv抗體庫(kù)，庫(kù)容都在1×109以上，但是其中只有一個(gè)抗體庫(kù)能夠?qū)Y選過程中使用的各種抗原(包括3種腫瘤抗原)都能夠產(chǎn)生高質(zhì)量的抗體，這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)有助于鼠病理模型的建立。兔抗體庫(kù)優(yōu)于鼠抗體庫(kù)，這是因?yàn)樵诿庖邞?yīng)答過程中兔的抗體基因重排較少。Mikhail Popkov［14］等分析 228 例兔抗體的 CDR3，發(fā)現(xiàn)兔的重鏈CDR3比鼠更接近人類。駝源性抗體僅由重鏈構(gòu)成，稱為重鏈抗體。由重鏈的VH組成的抗體稱為納米抗體。該抗體有易表達(dá)、水溶性強(qiáng)、耐高溫等特性，是工程化抗體的良好來(lái)源［15］。人源化抗體是當(dāng)前抗體工程的研究熱點(diǎn)。Zhong［16］等對(duì)半合成的人源ScFv文庫(kù)進(jìn)行篩選，成功獲得HBV、HCV、HEV等各種抗原的人源性ScFv。

1.4 抗體庫(kù)中展示抗體片段的選擇

噬菌體可以有效地展示單鏈可變區(qū)片段(scFv)、異二聚體的抗原結(jié)合區(qū)片段(Fab)、二硫鍵穩(wěn)定性抗體(dsFv)和雙價(jià)抗體(diabody)。大多數(shù)文庫(kù)采用的是scFv，但也有一些采用Fab。Fab和scFv分子小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于穿過組織，表達(dá)效率高，有利于腫瘤等疾病的治療［17］。Fab含有兩條鏈，具有難組裝、產(chǎn)量低的缺點(diǎn)，但是比scFv更穩(wěn)定，不存在二聚體現(xiàn)象。scFv的主要問題是易于形成二聚體，但是較易合成，耐受性好［18－19］。

2 噬菌體抗體庫(kù)的篩選

在運(yùn)用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)制備高質(zhì)量的單克隆抗體時(shí)，篩選起了至關(guān)重要的作用。噬菌體抗體庫(kù)的篩選包括淘選和鑒定。淘選即將抗體庫(kù)與選擇的抗原共同孵育，經(jīng)過“親和—吸附—洗脫—擴(kuò)增”的步驟篩選出目的抗體。一般需要3～4輪的淘選，才能得到優(yōu)質(zhì)抗體。鑒定包括PCR鑒定、ELASA鑒定、酶切鑒定等。傳統(tǒng)的篩選包括:①固相篩選，即將靶抗原包被在固相介質(zhì)上，加入待篩選的噬菌體，洗脫，并回收高親和力噬菌體，隨后感染大腸桿菌擴(kuò)增。② 液相篩選，即將靶抗原與生物素相連，再將其固定在包被有鏈親和素的磁珠上，在磁場(chǎng)的作用下將非特異性噬菌體和特異性噬菌體分開［20－21］。為了提高篩選效率，對(duì)傳統(tǒng)的固體篩選方法進(jìn)行了改進(jìn)，如將感染過程與篩選過程相關(guān)聯(lián)，產(chǎn)生了選擇性感染系統(tǒng)，又如用抗體代替抗原等。

但是傳統(tǒng)的方法僅適用于可以純化的抗原，對(duì)于抗原未知且無(wú)法提純的情況就不適用，于是出現(xiàn)了全細(xì)胞篩選。全細(xì)胞篩選被廣泛用于腫瘤細(xì)胞篩選，如肺癌［22］、前列腺癌［23］、血癌［24］等。對(duì)于一些細(xì)胞受體蛋白，可以通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染的技術(shù)，將靶抗原定位于細(xì)胞表面，從而以完整細(xì)胞進(jìn)行篩選［25］。噬菌體抗體庫(kù)也可以用細(xì)胞內(nèi)化進(jìn)行篩選，通過受體介導(dǎo)的作用，可以將抗體攜帶的藥物吞進(jìn)細(xì)胞內(nèi)起治療作用。篩選可內(nèi)化的抗體前提是抗體能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，以便將效應(yīng)分子帶入細(xì)胞。由于scFv半衰期短，在體內(nèi)易降解，又因?yàn)槭荏w介導(dǎo)的內(nèi)化過程通常伴隨受體的二聚化，所以內(nèi)化篩選更適用于Fab抗體片段。

3 噬菌體抗體庫(kù)的應(yīng)用

3.1 腫瘤研究方面的應(yīng)用

利用細(xì)胞篩選得到特異性的抗腫瘤抗原的抗體，將特異性抗體與藥物前體、酶、細(xì)胞因子等偶聯(lián)靶向定位到腫瘤局部，或者尋找腫瘤標(biāo)記蛋白是目前研究人員研究腫瘤生物學(xué)診斷治療的主要方向。曲妥珠單抗、利妥昔單抗、替伊莫單抗［26］等都是將單克隆抗體應(yīng)用于腫瘤治療的成功例子。Shui等［27］利用肝癌病人的外周血細(xì)胞，構(gòu)建了一個(gè)庫(kù)容為1.7×107Fab的抗體庫(kù)，用HpeG篩選得到一個(gè)特異性結(jié)合肝細(xì)胞瘤的抗體，這對(duì)推動(dòng)肝癌診斷和治療具有重要意義。將蛋白質(zhì)組分析技術(shù)與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合，尋找新的生物標(biāo)記蛋白也是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。Sunao Ima［28］等將蛋白質(zhì)組分析技術(shù)與組織芯片微量抗體免疫組化染色技術(shù)相結(jié)合，成功地從乳腺癌組織中鑒定出了Eph受體A10、TRAIL－R2、Cytokeratin 8，有助于乳腺癌診斷治療。

3.2 傳染病研究方面的應(yīng)用

噬菌體抗體對(duì)于傳染病的預(yù)防、診斷和治療，以及疫苗的研制具有巨大價(jià)值。目前，艾滋病已經(jīng)成為傳染病第一殺手。Vidita Choudhry［29］等用來(lái)自一個(gè)具有高度廣泛交叉反應(yīng)中和性抗體(bcnAbs)的HIV無(wú)進(jìn)展感染者的gp140作為抗原篩選一個(gè)免疫噬菌體抗體庫(kù)，得到一種罕見的特異性抗gp41的hmAb，并證明gp140可能含有誘導(dǎo)bcnAbs的保護(hù)性抗原表位。這個(gè)新抗體的發(fā)現(xiàn)有助于研究HIV免疫性和治療性疫苗。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)乙肝病毒攜帶者已達(dá)一億多人，目前的乙肝診斷主要采用的是乙肝五項(xiàng)檢查，但是抗HBe-Ab(+)慢性乙型肝炎和HBV慢性無(wú)癥狀攜帶者中，前S1抗原(+)可表示病毒的復(fù)制，提示臨床上只檢測(cè)“乙肝五項(xiàng)”是不夠的，補(bǔ)充前S1抗原的測(cè)定是十分重要的，可彌補(bǔ)因病毒變異和其他原因造成的 HBeAg( －)“誤診”。Sang Jick Kim［30］等發(fā)現(xiàn)一種可以和前S1抗原的一個(gè)表位 (Aa 37－45，NSNNPDWDF)結(jié)合的鼠源性HBV中和性抗體KR127，隨后將該表位突變?yōu)镾1(NANNPDWDF)，用融合有突變S1標(biāo)簽的血小板生成素的N末端免疫小鼠(該免疫抗原稱為nTPO－S1)，構(gòu)建一個(gè)Fab噬菌體展示抗體庫(kù)，用nTPO－S1篩選出高度特異性的抗體。這種抗體對(duì)前S1抗原的特異性是KR127的9倍，這有助于乙肝的輔助檢查，也為如何提高已知抗體的特異性提供了一個(gè)簡(jiǎn)便的方法。噬菌體抗體庫(kù)對(duì)動(dòng)物傳染病的防治也作出了巨大貢獻(xiàn)。Yuelan Zhao［31］等構(gòu)建了一個(gè)艾美球蟲裂殖子單鏈抗體庫(kù)，用冷凍保存的艾美球蟲裂殖子進(jìn)行淘選，篩選出的單鏈抗體可以在艾美球蟲裂殖子表面準(zhǔn)確定位，具有高度的特異性和親和性，這為球蟲病的診斷治療和疫苗的制備提供了有力的工具。

4 展望

噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用是生物技術(shù)領(lǐng)域中又一里程碑，使人們可以不經(jīng)過免疫而制得單克隆抗體。噬菌體抗體庫(kù)最大的優(yōu)點(diǎn)是實(shí)現(xiàn)了表型和基因型的統(tǒng)一，把抗原識(shí)別能力和擴(kuò)大生產(chǎn)的能力相結(jié)合，在人源性抗體的制備和篩選方面占有巨大優(yōu)勢(shì)［32］。一個(gè)好的噬菌體抗體庫(kù)應(yīng)該是庫(kù)容量大，多樣性良好。影響庫(kù)容的主要因素是篩選技術(shù)和大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率。優(yōu)化篩選技術(shù)對(duì)抗體庫(kù)的質(zhì)量至關(guān)重要。影響多樣性的因素主要是目的基因引物的優(yōu)化和PCR的過程。合理的引物設(shè)計(jì)是抗體庫(kù)多樣性的關(guān)鍵，尤其是在天然抗體庫(kù)中，直接影響著所構(gòu)建的抗體庫(kù)是否能夠真實(shí)地反映原始基因的分布。另外，最近有文獻(xiàn)報(bào)道，抗原的免疫過程也會(huì)影響抗體庫(kù)的質(zhì)量。Mai Yoshikawa［33］等分別給4組小鼠免疫純化的 HIV －1 Nef蛋白 25 μg、HIV －1 Nef蛋白 10 μg、HIV －1Vif蛋白 25 μg、HIV －1Vif蛋白 10 μg。14 d之后相同方式再次免疫，28 d之后對(duì)10 μg的小組再次進(jìn)行10 μg的劑量免疫，收集樣品，構(gòu)建抗體庫(kù)。結(jié)果25μg免疫劑量的小鼠組篩選得到的特異性抗體克隆明顯多于10 μg給藥的小鼠組。如何提高噬菌體抗體庫(kù)的多樣性和庫(kù)容還有待人們技術(shù)探索。目前美國(guó)FAD所批準(zhǔn)的治療性抗體和絕大多數(shù)臨床試驗(yàn)的單克隆抗體幾乎都是長(zhǎng)為150kD的IgG1［34］，這種高分子蛋白不易穿透組織，且不易與靶分子定位，但是小分子抗體在體內(nèi)半衰期短，且易發(fā)生二聚化，如何解決這些矛盾也是噬菌體發(fā)展過程中的難題。當(dāng)前最熱門的研究是完全人源化抗體，主要是通過篩選噬菌體人源抗體庫(kù)和基因工程小鼠制備。但是人源化抗體也有自身難以克服的困難，如人源化過程繁復(fù)、昂貴，需大量的電腦模擬，工作量非常大等?？偠灾删w抗體庫(kù)技術(shù)還處在發(fā)展之中，需要繼續(xù)完善和優(yōu)化。

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