地溝油中膽固醇的LC/MS/MS定性定量檢測(cè)

余雯靜，鄭 利，沈崇玉

(1.蘇州出入境檢驗(yàn)檢疫局，蘇州 215104;2.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局，南京 210001)

膽固醇、電導(dǎo)率、多環(huán)芳烴以及特定基因組成可用于地溝油的識(shí)別鑒定，這是因?yàn)檎嬲闹参镉椭兄饕泄如薮?、豆甾醇、菜油甾醇等多種植物甾醇，不含或含有極少量的膽固醇，而相對(duì)比膽固醇多存在于動(dòng)物油脂中。所以檢測(cè)過程中遇到油樣中的膽固醇含量高出預(yù)設(shè)的正常限值，即可高度懷疑該油脂可能為地溝油。但是結(jié)果的得出必需建立在確證化合物為膽固醇的基礎(chǔ)上。植物油谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇等植物甾醇在結(jié)構(gòu)上均與膽固醇十分相似，單一依靠前處理很難將其完全分離。目前膽固醇的分析常采用液相色譜法［1－3］、氣相色譜法［4］、熒光毛細(xì)分析法［5］、生化分析儀［6］、試劑盒［7］等，但是由于儀器的選擇性和靈敏度的限制，無法實(shí)現(xiàn)精確定性、定量。隨著研究的逐步深入，液質(zhì)的逐步推廣，采用三重四級(jí)桿質(zhì)譜研究化合物越來越多。除此之外，有學(xué)者采用將QTRAP類型液質(zhì)運(yùn)行不同于三重四級(jí)桿的多種掃描模式，并進(jìn)行譜庫(kù)搜索對(duì)化合物進(jìn)行確證［8－10］。本研究中采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀的多反應(yīng)監(jiān)控(MRM)模式以及增強(qiáng)子離子掃描(EPI)模式得到膽固醇的二級(jí)質(zhì)譜圖，一次進(jìn)樣同時(shí)實(shí)現(xiàn)膽固醇的定性定量檢測(cè)。

樣品經(jīng)皂化后提取膽固醇，經(jīng)色譜柱分離后進(jìn)入檢測(cè)器。本實(shí)驗(yàn)參照“GB/T 22220—2008食品中膽固醇的測(cè)定－高效液相色譜法”的前處理方法以及液相色譜條件［11］，通過添加基質(zhì)后的樣品模擬真實(shí)樣品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線以及質(zhì)控實(shí)驗(yàn)，完成方法的評(píng)價(jià)，利用AB SCIEX 4000 QTRAP質(zhì)譜儀MRM-IDA-EPI掃描模式定性定量檢測(cè)油樣中膽固醇。實(shí)驗(yàn)過程中，篩查本市餐飲行業(yè)使用油中膽固醇的含量，旨在為有關(guān)監(jiān)管部門辨別植物油中是否摻有地溝油提供一種準(zhǔn)確而且迅速確證及定性方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橄欖油、菜籽油、花生油、大豆油、花生調(diào)和油(市售)和煎炸老油以及地溝油;膽固醇標(biāo)樣(純度≥99%)，德國(guó)Sigma公司生產(chǎn);正己烷(分析純)、無水乙醇(分析純)、KOH(分析純)、氮?dú)?≥99.9%)、磷酸(分析純)、乙腈(分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

AB SCIEX 4000 QTRAP LC/MS/MS質(zhì)譜儀(AB SCIEX公司，配APCI離子源);Agilent 1200高效液相色譜儀(配自動(dòng)進(jìn)樣器，Agilent公司);10～200 μL 移液槍(Thermo公司);100～1 000 μL移液槍(Thermo公司);電子分析天平(感量0.000 1 g，METTLER TOLEDO公司);高速高速離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;氮吹儀。

1.3 前處理方法

1.3.1 樣品制備

取花生油50 mL，分別添加不同濃度膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品，充分混合，混合后樣品中膽固醇濃度為20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、1 000 ng/mL(標(biāo)記為驗(yàn)證品1～5號(hào))，以峰面積為縱坐標(biāo)，膽固醇濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中以添加濃度為50 ng/mL和200 ng/mL油樣作為對(duì)照品對(duì)方法進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.3.2 樣品前處理

稱取油樣3.0 g于250 mL平底燒瓶中，加入30 mL無水乙醇，10 mL60%氫氧化鉀溶液，混和均勻。將試樣在磁力攪拌加熱電熱套皂化回流1.5 h，溫度控制在98～102℃，皂化結(jié)束后冷卻至室溫，用5 mL無水乙醇自冷凝管頂端沖洗其內(nèi)部，即為皂化液。

1.3.3 提取

轉(zhuǎn)移皂化液于250 mL梨形瓶中，用少量無水乙醇洗滌燒瓶?jī)?nèi)部并將洗滌液合并入梨形瓶中。在45℃旋蒸近干，加入100 mL提取液(石油醚∶乙醚;50∶50)，在水浴中超聲 30 min，提取液6 000 r/min離心，將上清液轉(zhuǎn)移入500 mL分液漏斗，將剩余殘?jiān)?00 mL提取液超聲提取30 min，離心，合并上清液于分液漏斗中，再用40 mL提取液超聲提取10 min，離心后合并上清液于同一個(gè)分液漏斗中，用飽和NaCl水溶液洗滌分液漏斗中的有機(jī)相，直至中性。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至有機(jī)相接近蒸干，加入3 mL無水乙醇溶解瓶中殘留物，10 000 r/min離心，收集上清液用甲醇稀釋10倍即提取的膽固醇。每次取10 μL乙醇膽固醇溶液進(jìn)樣，進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 儀器方法

液相條件:采用 Phenomenex Kinetex C18(100X4.6mm，5 um)液相色譜柱，流動(dòng)相為VA(水)∶VB(甲醇)=5∶95 等度洗脫，柱溫35 ℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣體積10 μL。

儀器參數(shù):離子源，Turbo V;電離模式，APCI;采集方式，MRM-IDA-EPI;氣簾氣，15;碰撞氣，高;離子源溫度，500 ℃;NC，2;GAS1，25;GAS2，15;DP，45IDA。參數(shù):離子流預(yù)值，350 cps，不排除目標(biāo)離子。EPI參數(shù):DP，45 V;碰撞能量，20、30、40 eV;掃描范圍，m/z 50～400。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢驗(yàn)方法的確立

檢驗(yàn)過程中，膽固醇的分子量為386.6，脫掉一個(gè)水分子后離子化［M－H2O］+，m/z為369.4。逐步增加碰撞能量得到對(duì)應(yīng)的二級(jí)碎片，其中選擇 m/z 161.2為定性離子，碰撞能量 CE30，m/z 147.3為定量離子，碰撞能量CE35。得到二級(jí)質(zhì)譜圖(見圖1)。配合液相條件得到如圖2的色譜圖。

2.2 前處理方法驗(yàn)證

添加基質(zhì)的驗(yàn)證品1～5號(hào)油樣按照1.3節(jié)前處理方法中介紹步驟逐步實(shí)施，得到處理好的樣品，經(jīng)儀器采集數(shù)據(jù)，與未添加基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液對(duì)比，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖3)。經(jīng)驗(yàn)證方法回收率在82% ～93%，添加基質(zhì)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，線形相關(guān)系數(shù)R=0.994。

圖3 添加基質(zhì)得到的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 前處理方法穩(wěn)定性研究

以添加濃度為50 ng/mL和200 ng/mL油樣作為對(duì)照品，每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣20次，按照信噪比(S/N)為10∶1得到方法的最小定量限(S/N按峰峰比計(jì)算)、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(CV%)以及準(zhǔn)確度數(shù)據(jù)(見表1)。

表1 方法穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

2.4 同時(shí)定量、定性檢測(cè)

在膽固醇分析過程中，由于大量與其結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)的存在，傳統(tǒng)MRM模式無法獲得化合物的結(jié)構(gòu)信息，并且由于缺少LC/MS/MS圖譜庫(kù)等原因，使樣品檢驗(yàn)過程中容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，導(dǎo)致檢驗(yàn)結(jié)果可信度下降，所以僅以2對(duì)MRM離子難以確認(rèn)化合物。在本研究中采用MRM-IDA-EPI模式在以2對(duì)MRM離子定量的同時(shí)，得到膽固醇的二級(jí)質(zhì)譜圖，通過與預(yù)先添加到譜庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)品信息對(duì)比，進(jìn)行質(zhì)譜庫(kù)的檢索，其匹配度大于90%即可確認(rèn)為膽固醇。

2.5 加標(biāo)回收率與檢測(cè)結(jié)果

選擇市場(chǎng)所售不同品牌橄欖油、菜籽油、花生油、大豆油、花生調(diào)和油進(jìn)行加標(biāo)回收方法驗(yàn)證，其加標(biāo)濃度分別50 ng/mL和200 ng/mL膽固醇的回收率均大于82%，這為準(zhǔn)確檢測(cè)地溝油提供了技術(shù)保障。研究過程中從市場(chǎng)抽取10家餐飲行業(yè)用油，評(píng)估其油中膽固醇含量，檢驗(yàn)結(jié)果及添加膽固醇的好油的回收率數(shù)據(jù)見表2。

3 結(jié)束語(yǔ)

建立了用地溝油鑒別膽固醇的LC/MS/MS檢測(cè)方法，其中添加基質(zhì)的方法模擬真實(shí)樣品驗(yàn)證膽固醇檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度與精確度。在方法分析過程中，按照S/N為10∶1計(jì)算得到方法定量、定性分析的檢出限50 ng/mL，同時(shí)用QTRAP的增強(qiáng)子離子掃描功能(EPI)添加膽固醇到質(zhì)譜庫(kù)，通過對(duì)檢出限濃度的樣品進(jìn)行譜庫(kù)檢索，依據(jù)二級(jí)譜圖的匹配度確立化合物的成分。方法的確立不僅為定量結(jié)果提供定性數(shù)據(jù)支持，同時(shí)從根本上解決了傳統(tǒng)串聯(lián)四極桿質(zhì)譜對(duì)低濃度樣品只能定量不能定性的問題，極大地提高了食品安全分析中結(jié)果的可靠性。

表2 添加膽固醇及回收率數(shù)據(jù)

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