先天性心臟病相關bHLH轉錄因子的研究進展*

張永波綜述,仇小強審校

(桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院心內科,廣西桂林541001)

先天性心臟病(congenital heart disease,CHD)是由于胚胎發(fā)育過程中相關基因異常,導致心臟血管發(fā)育異常所形成的一組心血管系統(tǒng)畸形。CHD是人類最常見的出生缺陷之一,在新生兒中發(fā)病率估計為0.4%～5%[1],為嬰兒期非感染死亡的首位病因,也是自然流產(chǎn)和死胎最常見的原因之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計資料顯示,全球每年約150萬兒童出生時患有CHD。因此,完整理解心血管系統(tǒng)發(fā)育機制,從分子水平探索預防和治療CHD的措施,對降低嬰幼兒病死率、提高人口質量具有重要意義。

心臟是脊椎動物胚胎發(fā)育過程中最早形成的功能器官。心臟由不同胚層來源的細胞發(fā)育而來,是各種細胞經(jīng)過精準的特化、分化、遷移和組織結構的折疊、屈曲的結果。這一系列復雜的形態(tài)變化及精密的血流動力學改變均由一個核心轉錄因子調控網(wǎng)絡控制,其中主要包括堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白(bHLH)、NK2、GATA、TBX等。該調控網(wǎng)絡將上游誘導信號與下游調控基因聯(lián)系起來,控制心肌細胞的增殖和分化、心臟發(fā)育模式及形態(tài)發(fā)生和心臟收縮[2]。bHLH蛋白家族成員眾多、功能龐大在心臟形成過程中的作用尤為顯著,與CHD的發(fā)生關系密切。

1 bHLH結構和功能

bHLH包含60個左右氨基酸殘基,由兩個α螺旋通過一段環(huán)狀結構相連接,上游富含堿性氨基酸。兩條雙親性α螺旋的一側有亮氨酸和苯丙氨酸等疏水氨基酸,兩條鏈依賴疏水氨基酸的相互作用形成同二聚體或異二聚體,螺旋區(qū)含有各種保守的氨基酸殘基。bHLH通過螺旋-環(huán)-螺旋模體二聚體化,使每個長螺旋的堿性部分與DNA上E-盒序列CANNTG結合發(fā)揮調控作用。缺乏堿性區(qū)肽鏈的螺旋-環(huán)-螺旋蛋白與bHLH形成異二聚體,可以阻止bHLH與DNA結合,從而增加其調控作用的多樣性。bHLH幾乎存在于所有的真核生物中,是胚胎發(fā)育過程中重要的調節(jié)因子。已知動物bHLH超家族包含6個高階組共45個家族,每個家族由一至數(shù)個成員組成,分別在生物體神經(jīng)細胞、肌肉細胞、腸組織、心臟和造血細胞發(fā)育過程中發(fā)揮重要功能。目前研究認為與心血管發(fā)育關系密切的bHLH超家族成員主要有HAND家族和HRT家族。

2 心臟神經(jīng)嵴衍生物表達蛋白(heart and neural crest derivatives,HAND)家族

HAND屬于A組bHLH轉錄調節(jié)因子超家族成員,能夠與具有CACCTG或CAGCTG特征的E框DNA片段特異性結合。HAND家族有兩個成員HAND1和HAND2。HAND因子在不同物種之間表現(xiàn)出較高的氨基酸序列一致性,說明其生物功能具有高度保守性[3-4]。在心管形成前,HAND首先在心臟前體側壁中胚層、神經(jīng)嵴和腮弓上表達,然后持續(xù)表達于整個心臟發(fā)育過程中,直到心腔分化完成。雖然在哺乳動物心臟形態(tài)形成和早期胚胎心管不對稱環(huán)化過程中HAND1和HAND2最初是共同表達的,但隨后HAND1逐漸主要局限于在左心室表達,HAND2逐漸主要局限于在右心室表達[5],而在胚胎主動脈球囊、心室流出道以及早期室間隔中,HAND1和HAND2基因仍共同表達[3-4]。在整個心臟發(fā)育進程中,HAND基因表達逐漸下調。HAND基因在成人心臟的表達水平非常低,但在心臟出現(xiàn)疾病的時候可以再表達,特別在心臟肥大時HAND基因呈顯著的反應性高表達。HAND1基因在左心室的發(fā)育過程中起重要作用,Reamon-Buettner等[6]研究發(fā)現(xiàn),HAND1的bHLH結構域一個功能缺失性移碼突變(p.A126fs)在心臟發(fā)育不全中頻發(fā),在房室間隔缺損的組織樣本中,他們檢測到32個序列改變導致氨基酸的改變,其中12個序列是在HAND1的bHLH結構域。由此可以認為,HAND1對CHD的發(fā)生特別是房室間隔缺損的發(fā)生至關重要。Risebro等[7]通過培養(yǎng)胚胎干細胞源性心肌細胞研究揭示,在HAND1缺失的背景條件下心肌細胞分化顯著提高,但決定心肌細胞命運的中胚層通路明顯缺失。由此表明HAND1作為一個重要的心臟調節(jié)蛋白,控制著心臟發(fā)育過程中細胞增殖和分化之間的平衡。此外,當HAND1基因被插入到Mlc2v基因座內,HAND1基因在整個左、右心室發(fā)育過程中呈強勢過度表達并且引起房室間隔缺損[8]。Nkx2.5基因敲除小鼠的心臟HAND1基因表達障礙并出現(xiàn)嚴重的心室畸形,表明HAND1可能受Nkx2.5調控參與左心室的發(fā)育。HAND2能夠激活UFD1、CDC45等基因的轉錄,HAND2基因敲除小鼠出現(xiàn)右心室發(fā)育不良。Shen等[9]通過對131例中國CHD患兒HAND2突變體篩查表明,HAND2可能是右心室和流出道狹窄的潛在候選基因。HAND2缺失小鼠在胚胎發(fā)育9.5～10.5 d之間死于心臟和血管發(fā)育缺陷,表明HAND2缺失對胚胎發(fā)育是致命性的。內皮素及其受體在胚胎神經(jīng)嵴表達,當其缺乏時可出現(xiàn)大血管和心室流出道發(fā)育缺陷。內皮素或其受體缺陷小鼠HAND2水平下調,HAND2突變小鼠神經(jīng)纖毛蛋白-1(Neuropilin-1,NRP-1)水平下調,而 NRP-1突變體與內皮素突變體具有相似的表型[10],表明在胚胎神經(jīng)嵴發(fā)育過程中HAND2可能是調節(jié)內皮素和NRP-1表達的紐帶。形態(tài)學研究顯示,當HAND2缺失時心管環(huán)化成為右心室的區(qū)域缺失。相關分子研究表明,小鼠心肌細胞特化的發(fā)生是因為特異性心臟分子標記物的正常表達,然而當HAND2缺失時特異性心室標記物A型尿鈉肽前體(Nppa)的表達下調,而且這種減少由一個直接轉錄效應引起[11],相比之下HAND1的轉錄則對Nppa的表達無影響。Zhao等[12-13]經(jīng)過靶點搜尋發(fā)現(xiàn)有一類MicroRNA特異地結合HAND2的mRNA,阻止其翻譯成蛋白質,提示MicroRNA的異常表達可以通過影響HAND2的表達而導致胚胎發(fā)育初期心肌前體細胞的擴增受限,進而造成心室沒有足夠心肌細胞而發(fā)展為畸形。HAND因子的轉基因分析表明,HAND1和HAND2都是心血管正常發(fā)育的必需因子。HAND1和HAND2基因全部敲除的小鼠表現(xiàn)出心臟畸形[5]。當僅敲除心肌細胞系條件HAND1無效等位基因時,圍生期HAND1條件突變體表現(xiàn)出左心室和心內膜墊缺失、心室基因表達失調[14]。為了進一步了解HAND因子在心血管形態(tài)發(fā)育過程中調節(jié)心臟形成的機制以及直接檢測HAND1和HAND2的功能冗余,Firuui等[15],把 HAND2基因插入到HAND1基因座內(HD1HD2),值得注意的是,含HD1HD2嵌合體百分比高的小鼠在出生時就已經(jīng)死亡并表現(xiàn)出一系列先天性心臟畸形,表型觀察顯示,在正常發(fā)育的心臟中出現(xiàn)內源性HAND1表達。這些研究表明,哺乳動物的HAND基因可能在心臟進化過程中具有錯綜復雜的特殊功能[14],HAND在胚胎發(fā)育不同階段的選擇性表達是正常心臟形態(tài)發(fā)育的關鍵因子。

3 Hairy相關轉錄因子(Hairy-related transeription factor,HRT)

HRT屬于E組bHLH轉錄因子超家族成員,能夠優(yōu)先與具有CACGCG或CACGAG堿基的N框DNA序列結合,動物HRT包括HEY家族和HES家族。HRT具有3個保守結構域,其中bHLH結構域和橙色結構域是共有結構域。HRT的堿性區(qū)結構域有一個固定的甘氨酸,能夠與DNA特異性結合發(fā)揮轉錄抑制作用。Notch信號通路的轉錄復合物對HRT基因表達具有轉錄激活作用,由HRT編碼的蛋白又能夠進一步調控自身和其他下游分子的表達[16],HRT在Notch信號通路中發(fā)揮調節(jié)樞紐作用。HEY家族有 3個成員 HEY1、HEY2、HEYL,HEY1和HEY2在房室交界區(qū)的表達具有明顯的邊界,它們可能參與早期心管的分段。HEY1首先表達于新月形生心區(qū),10.5 d后局限于心房肌中;HEY2在心管形成階段表達于心室區(qū),當心腔形成后局限于心肌致密層[17],HEY1和HEY2的表達水平在出生后逐漸下降。房室管形成后,在鄰近心肌誘導信號刺激下內皮細胞向間葉細胞轉化(epithelial to mesenchymal transition,EMT),此時 HEYl、HEY2 和 HEYL均在房室管的心內膜處表達。HEYl、HEY2雙突變會導致EMT不足,HEYl和HEYL則在心血管發(fā)育過程中控制著內皮-間質細胞移行[18]。HEYl和 HEYL聯(lián)合缺失造成EM T嚴重低下并導致膜部室間隔缺損和瓣膜發(fā)育不良等多種心臟畸形。HEY2基因缺陷小鼠出現(xiàn)心肌收縮功能受損、右心室畸形、室間隔缺損和法樂氏四聯(lián)癥[19],并且左心室中檢出較多心房組織標志物(ANF、TBX5、Mlcla/2a);而當 HEY2過度表達時,心房標志物表達水平明顯下降[20]。國內有文獻研究發(fā)現(xiàn)[21-22],房間隔缺損和動脈導管未閉手術閉合后血清ANF水平顯著下降。Fischer等[23]認為,HEY2通過抑制心室致密層中廣泛存在的GATA4和GA TA6活性,防止心房標志物錯誤表達,從而維持心肌的正常發(fā)育。HEY2基因缺失將導致包括室間隔缺損、房室瓣膜缺陷、肺動脈瓣狹窄等心臟畸形的發(fā)生,而HEY1基因敲除小鼠沒有明顯的病理表現(xiàn)。盡管如此,HEY1和HEY2基因雙敲除的小鼠卻由于嚴重的心血管問題死于胚胎期。Kokubo等[24]發(fā)現(xiàn),HEY1和HEY2基因雙敲除小鼠表現(xiàn)出肌小梁缺陷,雖然最初的心室腔具有致密部和小梁部,可是接下來小梁部的心肌細胞凋亡最終導致肌小梁的發(fā)育缺陷。上述研究亦表明,在心血管發(fā)育過程中 HEY1和HEY2可能存在部分功能重疊。HEY1和HEYL雙失活小鼠也表現(xiàn)出嚴重的心臟畸形,如膜性室間隔缺損、房室瓣和肺動脈瓣發(fā)育異常。HES家族有 8個成員,其中 HES1、HES2在心血管系統(tǒng)形成過程中具有重要作用。HES1和HES2過度表達可以抑制心臟特異性轉錄因子TBX2和BMP2,導致房室管界線消失,HES1、HES2基因敲除大鼠的TBX2和BM P2基因表達范圍明顯擴大,表明 HES1和HES2可以通過調控TBX2和 BMP2基因表達影響房室管界線形成[25]。

綜上所述,一方面bHLH作為心臟形成過程中的核心轉錄因子,可以與目的基因特異性結合調控靶基因轉錄,同時bHLH的另一結構域可以與其他蛋白因子相互作用調節(jié)其調控轉錄的方向和速率。另一方面,編碼bHLH的基因又受其他轉錄因子的調控。如此一來不同蛋白因子和基因之間交織形成了一個精密的復雜調控網(wǎng)絡。雖然通過大量研究,目前對心血管發(fā)育的分子調控機制已有較多認識,但離完整精確地理解還相差甚遠,更談不上真正的用于臨床治療[26]。因此深入研究bHLH在心臟發(fā)育過程中的調控機制,進一步了解其與CHD的關系具有重要意義。

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