Narc-1在動(dòng)脈粥樣硬化中的表達(dá)及意義

張艷平 丁矢 向秋玲 李雪蘭 歐勇 袁莉

動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的諸多影響因素中，血脂水平代謝異常是造成動(dòng)脈粥樣硬化死亡率及罹患率增加的主要因素[1]。最近發(fā)現(xiàn)，人類前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin 9，PCSK9)是2003年發(fā)現(xiàn)的涉及常染色體顯性高膽固醇血癥的第三個(gè)基因[2]，編碼前蛋白轉(zhuǎn)化酶NARC-1(neural apoptosis-regulated convertase 1)。pcsk9基因連鎖顯示其與常染色體顯性遺傳的高膽固醇血癥有關(guān)。目前Narc-1/pcsk9作為一個(gè)新的治療靶點(diǎn)已成為高膽固醇血癥和動(dòng)脈粥樣硬化研究的熱點(diǎn)，對(duì)進(jìn)一步深入探索新的防治途徑具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料30只健康純種雄性新西蘭大白兔由湖南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;NARC-1免疫印跡試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司;蘇木素復(fù)染液以及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自福州邁新公司。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。DMR+Q550型圖像分析儀系德國(guó)Leic公司產(chǎn)。

1.2 動(dòng)物模型建立與實(shí)驗(yàn)分組選取5月齡健康純種雄性新西蘭大白兔30只，體質(zhì)量(2.3±0.8)kg。采用單籠喂養(yǎng)，飲水不限。通過適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為兩組:對(duì)照組(A組)15只，給予飼喂普通顆粒飼料;高膽固醇組(B組)15只，給予飼喂常規(guī)顆粒飼料中添加5%膽固醇、8%豬油、7%蛋黃粉。兩組分別喂養(yǎng)12周。

1.3 病理組織學(xué)檢測(cè)喂養(yǎng)12周末，經(jīng)耳緣靜脈注射空氣15～20 ml處死動(dòng)物后，剖開胸腔及腹腔，將心臟至左右髂動(dòng)脈分叉處的主動(dòng)脈離斷并縱行剖開，生理鹽水沖洗血管壁內(nèi)外殘血，4%多聚甲醛固定，進(jìn)行蘇丹Ⅲ染色，取遠(yuǎn)端1.5 crn處組織放入液氮中保存，用于免疫印跡。免疫印跡分析按照試劑盒的說明進(jìn)行。應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)測(cè)定斑塊面積。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，組內(nèi)及組間對(duì)照采用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高膽固醇對(duì)主動(dòng)脈內(nèi)膜的影響肉眼下正常對(duì)照組管腔面光滑，無脂質(zhì)沉積;高膽固醇組出現(xiàn)了明顯的動(dòng)脈粥樣硬化病變，脈管壁大量干酪樣脂質(zhì)斑塊物質(zhì)凸向管腔。經(jīng)圖像分析儀檢測(cè)，高膽固醇組主動(dòng)脈內(nèi)膜面粥樣硬化病變面積為(27.41±2.12)%，與對(duì)照組(0.51±0.20)%相比顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 形態(tài)學(xué)改變光鏡下正常對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞完整，管腔內(nèi)皮光滑，血管壁層次清晰，無明顯增生。高膽固醇喂養(yǎng)組動(dòng)物血管壁結(jié)構(gòu)紊亂，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、變性，部分缺失;內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)含大量泡沫細(xì)胞，內(nèi)彈力膜斷裂，可見斑塊形成;中膜不規(guī)則增生，平滑肌細(xì)胞排列紊亂，胞體變大，可見鈣化斑，斑塊中大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.3 主動(dòng)脈NARC-1表達(dá)的比較免疫組化顯示正常對(duì)照組主動(dòng)脈組織中僅見少量棕色染色顆粒，高膽固醇組主動(dòng)脈組織中NARC-1呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，尤以斑塊中的表達(dá)最為明顯。高膽固醇喂養(yǎng)組動(dòng)物主動(dòng)脈中NARC-1的表達(dá)(7532±323)pixel intensity/mm2/μg較正常對(duì)照組(1532±452)pixel intensity/mm2/μg顯著升高，經(jīng)t檢驗(yàn)，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

血脂代謝水平紊亂是造成動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的最主要的危險(xiǎn)因素，而血液中脂質(zhì)代謝異常為多個(gè)基因之間或多個(gè)基因與環(huán)境因素之間相互作用的結(jié)果。近來研究發(fā)現(xiàn)，Narc-1/pcsk9主要作用是通過負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞表面的LDLR表達(dá)來減少LDL肝攝取，從而使血漿LDL清除減少和LDL-膽固醇(LDLC)升高[3]。PCSK9在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中以可溶性酶原的前體形式合成，經(jīng)過分子內(nèi)自我催化加工生成成熟蛋白后分泌到血漿中發(fā)揮其自身作用[4]。大量的臨床流行病學(xué)資料一致證實(shí)，高LDL膽固醇血癥是一個(gè)已被確認(rèn)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，表明血清低密度脂蛋白膽固醇升高可誘發(fā)和促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展[5]。本實(shí)驗(yàn)采用高膽固醇顆粒食物喂養(yǎng)動(dòng)物12周后，肉眼下高膽固醇組出現(xiàn)了明顯的動(dòng)脈粥樣硬化病變，脈管壁大量干酪樣脂質(zhì)斑塊物質(zhì)凸向管腔，經(jīng)檢測(cè)主動(dòng)脈內(nèi)膜面粥樣硬化病變面積(27.41%±2.12)%較正常對(duì)照組(0.51%±0.20%)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果證實(shí)高脂食物確實(shí)是誘發(fā)動(dòng)脈硬化發(fā)生的因素之一。

有研究發(fā)現(xiàn)PCSK9突變引起常染色體顯性高膽固醇血癥，PCSK9突變形式多樣，有PCSK9基因錯(cuò)義突變的人群，其血漿LDLC水平明顯降低，表明抑制PCSK9的活性有助于增加LDLR數(shù)量[6]。同樣的研究結(jié)果也出現(xiàn)在PCSK9基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)中，PCSK9基因敲除小鼠的肝細(xì)胞LDLR受體數(shù)量明顯增多，并加速了血漿LDL的清除，從而降低了LDLC水平[7]。然而無論是野生型還是突變體，PCSK9的過表達(dá)都是通過翻譯后機(jī)制來降低LDL-R的水平。本實(shí)驗(yàn)通過建立動(dòng)脈硬化動(dòng)物模型，檢測(cè)出動(dòng)脈硬化組動(dòng)物主動(dòng)脈內(nèi)膜NARC-1蛋白的表達(dá)(7532±323)pixel intensity/mm2/μg較正常對(duì)照組(1532±452)pixel intensity/mm2/μg顯著升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。證實(shí)NARC-1與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生是相關(guān)的。

目前，有國(guó)外文獻(xiàn)認(rèn)為PCSK9從兩方面影響血漿中LDLC的水平，一是維持合適的LDLR水平;二是調(diào)節(jié)apoB的分泌量。Narc-1/pcsk9可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞表面低密度脂蛋白受體(LDLR)，PCSK9和LDLR也共同受到膽固醇的調(diào)節(jié)，PCSK9是通過調(diào)節(jié)LDLR功能另一新的旁路機(jī)制，還是經(jīng)典的通過SREBP介導(dǎo)的膽固醇抑制轉(zhuǎn)錄效應(yīng)，還有待我們深入研究探討，也能為動(dòng)脈粥樣硬化的研究提供更有效地藥物防治方法和途徑。

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