高糖中膀胱ICCs超微結(jié)構(gòu)的變化

范勇洪

作為膀胱舒縮活動(dòng)的起搏和傳導(dǎo)者，ICCs細(xì)胞在膀胱活動(dòng)中起著關(guān)鍵作用［1］。其功能改變可能是造成膀胱功能障礙的原因。因此推測(cè)，DCP發(fā)病可能與ICCs改變有關(guān)。本研究通過單細(xì)胞培養(yǎng)、觀察ICCs超微結(jié)構(gòu)在高糖環(huán)境中的變化，探討DCP功能改變的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 英國種健康豚鼠，透射電鏡。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠膀胱ICCs細(xì)胞的體外培養(yǎng)和制備 脫臼處死豚鼠，無菌手術(shù)取出其膀胱，取肌層并剪成碎塊，膠原酶V消化，制成無糖的DMEM細(xì)胞懸液于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去原液，分別加入5、10、15 mmol/L葡萄糖 DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24、72 h。胰蛋白酶消化，刮刀刮取ICCs細(xì)胞，高速離心，戊二醛固定細(xì)胞團(tuán)。

1.2.2 電鏡觀察 細(xì)胞團(tuán)經(jīng)沖洗、固定、梯度序列丙酮浸泡脫水、聚合后，超薄切片，再醋酸鈾、檸檬酸鉛順序染色后，切片置于透射電鏡下，選圖像清晰之ICCs細(xì)胞觀察。

2 結(jié)果

ICCs細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)在高濃度糖環(huán)境中發(fā)生明顯變化，隨培養(yǎng)液中糖濃度升高及時(shí)間增長，ICCs細(xì)胞損害也就越明顯。①5 mol組培養(yǎng)24和72 h組后，ICCs細(xì)胞無明顯變化，鏡下見核仁大而多，核漿比例大，線粒體豐富，胞突長而少。②10 mol組培養(yǎng)24 h則見核仁多，邊集，核漿比例大，細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞器減少，比如核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)開始擴(kuò)張，胞突變短，細(xì)胞內(nèi)較多顆粒狀類釋放物存在，多位于胞突內(nèi)，顆粒狀物外有被膜。培養(yǎng)72 h后可見核仁大，數(shù)量多且形態(tài)不規(guī)則，核漿比例增大，細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞器更少，細(xì)胞內(nèi)顆粒狀類釋放物更多，位于胞突，并且有向外釋放之勢(shì)，胞突特別多且更短。③15 mol組培養(yǎng)24 h后可見細(xì)胞分散，不成片，細(xì)胞體積增大，其內(nèi)顆粒狀類釋放物較多，也存在于胞突，細(xì)胞器也明顯減少，胞突幾近于消失。培養(yǎng)72 h后可見細(xì)胞不成片，細(xì)胞體積增大，核大，其內(nèi)異染色質(zhì)明顯減少，胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體數(shù)目極少，線粒體明顯大小不一，游離核糖體增加，部分細(xì)胞膜局部呈現(xiàn)壞死灶，胞突完全消失。

3 討論

眾多科研成果提示ICCs細(xì)胞在膀胱活動(dòng)的起搏器、傳導(dǎo)器。膀胱不依賴神經(jīng)以及體液因素可以自發(fā)的興奮、收縮［2］，ICCs細(xì)胞可測(cè)到自發(fā)的電位變化［3］，尿路全程均有ICCs存在［4-6］。糖尿病最常見癥狀之一是DCP，其病變?cè)虿幻鞔_。因此我們推測(cè)，ICCs細(xì)胞功能變化可能與DCP發(fā)病有關(guān)?？赡苁歉咛瞧茐腎CCs超微結(jié)構(gòu)引起DCP的事發(fā)病。

本次研究用單種細(xì)胞體外培養(yǎng)，來觀察高葡萄糖濃度下膀胱ICCs內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)的變化。發(fā)現(xiàn)糖濃度升高及培養(yǎng)時(shí)間長，ICCs細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)破壞就越明顯。

圖片對(duì)比可見，5 mol/L糖濃度沒有影響ICCs細(xì)胞，胞內(nèi)細(xì)胞器豐富，胞突少而長，即生理范圍內(nèi)的糖濃度不影響ICCs。10 mol/L經(jīng)培養(yǎng)24和72 h后均明顯出現(xiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，核仁多，邊集，核漿比例大，細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞器比如核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)開始擴(kuò)張，胞突變短，細(xì)胞內(nèi)較多顆粒狀類釋放物存在，多位于胞突內(nèi)，顆粒狀物外有被膜。而培養(yǎng)72 h后細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞更明顯，核仁大而多，且形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞器更少，而顆粒狀類釋放物更多，并且有向外釋放之勢(shì)，胞突多且更短，呈絨毛狀。推測(cè)高濃度糖刺激下，破壞ICCs內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)，刺激ICCs細(xì)胞代償性生理功能增強(qiáng)，造成其分泌顆粒如神經(jīng)遞質(zhì)等增加。15 mol/L組細(xì)胞破壞更甚于10 mol組.培養(yǎng)24 h后細(xì)胞分散，不成片，細(xì)胞體積增大，顆粒狀類釋放物較多，細(xì)胞器也明顯減少，胞突幾近于消失。培養(yǎng)72 h后，細(xì)胞不成片，核內(nèi)異染色質(zhì)明顯減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體數(shù)目極少，線粒體明顯大小不一，游離核糖體增加，部分細(xì)胞膜局部呈現(xiàn)壞死灶，胞突完全消失。過高的葡萄糖濃度刺激，短時(shí)間內(nèi)可造成ICCs細(xì)胞代償性功能增加，但培養(yǎng)時(shí)間增長，過高的葡萄糖濃度持續(xù)的破壞，使細(xì)胞能量來源的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)線粒體被破壞，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體脫落，造成ICCs細(xì)胞生理功能喪失或下降。

研究結(jié)果顯示，ICCs功能及其結(jié)構(gòu)的變化與高濃度糖的內(nèi)環(huán)境有密切關(guān)系。內(nèi)環(huán)境中糖濃度的升高、作用的時(shí)間長，則ICCs細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能變化也就更明顯。由此推測(cè)：高濃度糖破壞ICCs細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)、胞突消失，造成該類細(xì)胞的起搏和傳遞中介的功能、結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致膀胱興奮能力變化，膀胱逼尿肌舒縮能力產(chǎn)生變化，而使DCP臨床癥狀出現(xiàn)。高糖中ICCs細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)被破壞有可能是臨床發(fā)生DCP的病理基礎(chǔ)之一。

［1］Jiang HH，SongB，Lu GS，et al.Loss of ryanodine receptor calcium release channel expression associated with overactive urinary bladder smooth muscle contractions in adetrusor instability model．BJU Int，2005，96(3)：428-433．

［2］Andersson KE，Arner A.Urinary bladder contraction and relaxation;physiology and pathophysiology. Physiol Rev，2004，84：935-986．

［3］McCloskey KD.Characterization of outward currents in interstitial cells from the guinea pig bladder．J Urol，2005，173：(1)：296-301．

［4］Davidson R A，McCloskey KD.Morphology and localization of interstitial cells in the guinea pig bladder：structural relationships with smooth muscle and neurons．J Urol，2005，173(4)：1385-1390．

［5］McCloskey KD，Gurney AM.Kit positive cells in the guinea pig bladder．J Urol，2002，168(2)：832-836．

［6］Exintaris B，Klemm MF，Lang RJ.Spontaneous slow wave and ontractile activity of the guinea pig prostate．，J Urol，2002，168(1)：315-322．