血液腫瘤自體造血干細(xì)胞移植后患者的DC/CIK培養(yǎng)及臨床應(yīng)用安全性觀察

薛重重 楊麗萍 徐新 許紅雁 韋湘 溫偉英 黃剛

血液腫瘤自體造血干細(xì)胞移植后患者的DC/CIK培養(yǎng)及臨床應(yīng)用安全性觀察

薛重重 楊麗萍 徐新 許紅雁 韋湘 溫偉英 黃剛

目的采用自體造血干細(xì)胞移植后完全緩解的血液腫瘤患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增出樹突狀細(xì)胞(dendritic cell DC)/細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer cell CIK)，應(yīng)用DC/CIK細(xì)胞免疫治療自體造血干細(xì)胞移植后完全緩解血液腫瘤患者，觀察其不良反應(yīng)。方法采集10例血液腫瘤自體造血干細(xì)胞移植后完全緩解患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞，在體外經(jīng)GM-CSF、IL-4、TNF-α等誘導(dǎo)產(chǎn)生DC，經(jīng)IFN-γ、抗CD3單抗、IL-2等誘導(dǎo)產(chǎn)生CIK，觀察其細(xì)胞形態(tài)及臨床應(yīng)用的不良反應(yīng)并分析其細(xì)胞免疫表型。結(jié)果培養(yǎng)產(chǎn)生形態(tài)學(xué)典型的DC/CIK。誘導(dǎo)成熟的DC經(jīng)流式細(xì)胞儀分析顯示CD80、CD83、CD86、CD1a等陽性細(xì)胞比率大幅上升。CIK隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，CD3+CD56+、CD3+CD8+雙陽性細(xì)胞的比率亦大幅度上升。在DC/CIK細(xì)胞免疫治療過程中，3例患者DC注射部位出現(xiàn)輕微疼痛，可自行緩解。2例患者輸注CIK后出現(xiàn)低熱，持續(xù)時(shí)間2～6 h，可自行消退。4例患者輸注完CIK后出現(xiàn)乏力，約2 h可自行緩解。結(jié)論自體造血干細(xì)胞移植后完全緩解患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞對DC/CIK的培養(yǎng)不受影響。DC/CIK細(xì)胞免疫治療自體造血干細(xì)胞移植后完全緩解的血液腫瘤患者，安全性好，不良反應(yīng)少。

細(xì)胞免疫治療;自體造血干細(xì)胞移植;血液腫瘤

DC和CIK是腫瘤免疫治療的兩個(gè)重要部分，前者識(shí)別抗原、激活獲得性免疫系統(tǒng)，后者通過發(fā)揮自身細(xì)胞毒性和分泌細(xì)胞因子殺傷腫瘤細(xì)胞，二者聯(lián)合確保了一個(gè)高效和諧的免疫體系。將具有強(qiáng)大腫瘤抗原提呈能力的DC和具有高效殺傷活性的CIK聯(lián)合應(yīng)用于治療惡性腫瘤，有助于增強(qiáng)腫瘤患者T細(xì)胞免疫能力，起到抗腫瘤作用［1］?；谝陨螪C/CIK的生物學(xué)特性，我們在建立DC/CIK培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上，開展了DC/CIK過繼細(xì)胞免疫治療血液腫瘤自體造血干細(xì)胞移植后緩解患者的臨床安全性研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 10例患者為汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院血液內(nèi)科住院并確診的血液腫瘤自體造血干細(xì)胞移植后緩解的患者。男4例，女6例，平均年齡48歲(33～63歲)，其中急性髓細(xì)胞白血病(Acute myelocytic leukemia，AML)3例，非霍奇金淋巴瘤(Non Hodgkin lymphoma，NHL)5例，多發(fā)性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)2例。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 COBE Spectra血細(xì)胞分離機(jī)(美國COBE公司);SANYO MCO-18AICUV CO2培養(yǎng)箱(日本三洋公司);倒置顯微鏡(廣州粵顯光學(xué)儀器有限責(zé)任公司);FACS-Calibuer流式細(xì)胞儀(美國Becton-Dickinson公司);RPMI 1640培養(yǎng)基、小鼠抗人CD3單克隆抗體(北京博特納生物科技有限公司);GM-CSF(遼寧衛(wèi)星生物制品研究所);IL-4、TNF-α(美國Peppotechinc公司);IFN-γ(上?？寺∩锔呒夹g(shù)有限公司);IL-2(北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司)。

1.3 DC/CIK細(xì)胞的培養(yǎng) 在患者簽署知情同意書以后，用血細(xì)胞分離機(jī)采集患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液離心獲得單個(gè)核細(xì)胞，讓細(xì)胞貼壁生長2 h。將獲得患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的貼壁細(xì)胞調(diào)細(xì)胞密度為5×106/ml進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)體系:GM-CSF 1000 u/ml、IL-4 500 u/ml、TNF-α500 u/ml，每3 d更換新鮮培養(yǎng)液，誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為7～13 d。CIK的體外培養(yǎng):將獲得患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的懸浮細(xì)胞調(diào)細(xì)胞密度為2×106/ml進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)體系:CD3單抗50 ng/ml、IFN-γ2000 u/ml、IL-2 1000 u/mll，每3 d 更換新鮮培養(yǎng)液，誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為9～13 d。

1.4 DC/CIK細(xì)胞的回輸 經(jīng)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，DC/CIK經(jīng)過質(zhì)檢合格(包括細(xì)菌、霉菌培養(yǎng)陰性，細(xì)胞活性大于95%等)進(jìn)行細(xì)胞免疫治療。DC經(jīng)皮下注射(雙頸部、腋下、腹股溝淋巴結(jié)區(qū)域共6個(gè)部位)。CIK經(jīng)靜脈回輸。

1.5 DC/CIK細(xì)胞免疫表型 DC檢測:CD80、CD83、CD86、CD14、CD1a、HLA-DR。CIK 檢測:CD3+CD56+、CD3+CD8+、CD3+CD4+。

1.6 不良反應(yīng)的觀察 DC/CIK治療中密切觀察不良反應(yīng)，如發(fā)熱、寒戰(zhàn)、胸悶、心悸等;治療過程中所有患者隔日檢查一次血常規(guī)、大小便常規(guī)、肝腎功能及心肌酶等，每周檢查一次心電圖。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 檢測數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t檢驗(yàn)用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 DC/CIK細(xì)胞培養(yǎng)過程中的質(zhì)量控制 每例患者的DC/CIK細(xì)胞培養(yǎng)過程中均進(jìn)行多次的細(xì)菌、霉菌的檢查。結(jié)果所有樣本檢測均為陰性，確保細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞回輸?shù)陌踩?/p>

2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間DC/CIK免疫表型的變化 10例患者的DC/CIK細(xì)胞免疫表型隨培養(yǎng)時(shí)間的變化而變化，誘導(dǎo)成熟的DC經(jīng)流式細(xì)胞儀分析顯示培養(yǎng)第13天，CD80的平均陽性率為94.83%、CD83的平均陽性率為80.84%、CD86的平均陽性率為91.70%、CD1a的平均陽性率為81.52%、HLADR的平均陽性率為95.42%。CIK培養(yǎng)后CD3+CD56+、CD3+CD8+雙陽性比率明顯升高，培養(yǎng)的第13天平均陽性率分別為48.05%和65.71%，而CD3+CD4+雙陽性比率則明顯下降。

2.3 不同培養(yǎng)時(shí)間DC/CIK細(xì)胞形態(tài)的變化 DC培養(yǎng)第2天細(xì)胞體積開始變大;3 d左右細(xì)胞開始出現(xiàn)變形，拉長呈梭形及放射狀等各種不規(guī)則的形態(tài)，部分細(xì)胞開始懸浮;培養(yǎng)7 d左右，集落明顯增多，有更多的細(xì)胞處于輕貼壁狀態(tài);培養(yǎng)9 d左右大部分細(xì)胞開始懸浮，形態(tài)不規(guī)則，鏡下可見大量具有毛刺狀突起的細(xì)胞，為典型的DC形態(tài)。CIK培養(yǎng)第5天左右開始倍增，細(xì)胞體積明顯增大，呈現(xiàn)母細(xì)胞化，并成簇生長;在培養(yǎng)的第7天，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞團(tuán)更大，懸浮在培養(yǎng)液中。

2.4 DC/CIK細(xì)胞治療的不良反應(yīng) DC皮下注射過程中、CIK回輸后4例患者無不適，3例患者DC注射部位有輕微疼痛，10～15 min后可自行緩解。CIK回輸后1例患者出現(xiàn)低熱、乏力癥狀，1 h后緩解，1例患者出現(xiàn)低熱持續(xù)2 h左右，可自行緩解，3例患者出現(xiàn)乏力1 h后可自行緩解，所有患者回輸中及回輸后均未出現(xiàn)寒戰(zhàn)、胸悶等不適，亦未出現(xiàn)皮疹等過敏反應(yīng)。在治療過程中，患者一般情況良好，無肝腎功能損害，心肺功能亦無影響。

3 討論

DC和CIK是腫瘤免疫治療的兩個(gè)重要部分，將DC與CIK聯(lián)合起來治療血液腫瘤，將有助于解除部分腫瘤患者T細(xì)胞的免疫能力，從而發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。

未成熟DC在外周組織捕獲抗原后，需經(jīng)引流淋巴管遷移至局部淋巴結(jié)，在淋巴結(jié)T細(xì)胞區(qū)與初始型T細(xì)胞接觸并活化初始型T細(xì)胞，因此，DC的輸注途徑可能決定了細(xì)胞免疫能否發(fā)生及發(fā)生的強(qiáng)弱。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，皮下和皮內(nèi)注射DC比靜脈注射更易誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)［2］。Fong等［3］將體外至敏的DC分別采取皮內(nèi)、淋巴管及靜脈三種不同的途徑輸入前列腺癌患者體內(nèi)，研究發(fā)現(xiàn)三種途徑雖然均能誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答，但反應(yīng)程度各不相同。經(jīng)皮內(nèi)和淋巴管途徑能產(chǎn)生高水平的TNF-γ，更易誘導(dǎo)Th1應(yīng)答。目前認(rèn)為靜脈注射有利于DC在體內(nèi)的分布，但也可能大部分被肝臟清除和抑制，皮下淋巴結(jié)區(qū)域注射有利于DC和T細(xì)胞的接觸。岳欣等［4］研究不同輸注途徑對CIK治療后的體內(nèi)分布的影響，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明CIK輸入體內(nèi)后，迅速分布至肝、脾、腎、肺、胃、腸等器官，其中肝、脾、腎的分布濃度最高，CIK輸入體內(nèi)的早期，尾靜脈注射途徑中肺最先達(dá)到分布高峰，而腹腔注射途徑中腹腔內(nèi)器官率先達(dá)到分布高峰。研究表明，CIK體內(nèi)分布的廣泛性表明它可以用于身體各部位惡性腫瘤的治療，而血管輸入途徑可能更適于血供豐富器官腫瘤的治療，而體腔輸入途徑也許更適合于體腔內(nèi)惡性滲液或局限病灶的治療。

到目前為止未見DC應(yīng)用于腫瘤的臨床免疫治療出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)報(bào)道。Reichart等［5］對12例HSCT后多發(fā)性骨髓瘤患者使用Id致敏的DC進(jìn)行免疫治療，所有患者治療過程中及治療后無明顯毒副反應(yīng)，治療后2例CR患者產(chǎn)生了Id特異性的T細(xì)胞增生性免疫反應(yīng)并且一直保持CR，其中1例HSCT無效的患者未經(jīng)進(jìn)一步化療，只接受DC免疫治療，目前仍存活達(dá)20個(gè)月。張樂萍等［6］臨床應(yīng)用CIK與IL-2聯(lián)合治療兒童ALL微小殘留病灶(MRD)，結(jié)果顯示:14例患者應(yīng)用CIK/IL-2治療，輸注過程中無1例出現(xiàn)寒戰(zhàn)、發(fā)熱、過敏。對心肺功能影響不大;輸注后外周血白細(xì)胞略有升高，血紅蛋白和血小板無變化，說明CIK具有安全性。治療組隨訪5～33個(gè)月無1例復(fù)發(fā)，生存時(shí)間超過30～54個(gè)月，且骨髓形態(tài)學(xué)和MRD檢測均為陰性。對照組8例復(fù)發(fā)死亡，兩組復(fù)發(fā)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。石永進(jìn)等［7］應(yīng)用自體CIK對5名惡性血液系統(tǒng)腫瘤患者進(jìn)行治療，回輸時(shí)患者未出現(xiàn)明顯毒副反應(yīng)，回輸后行心、肝、腎等器官功能檢測未出現(xiàn)新的異常。隨訪22～26個(gè)月，其中APL患者CIK治療前PML-RARα融合基因?yàn)殛栃?，CIK回輸后轉(zhuǎn)為陰性，2年后檢查仍為陰性;除AML M4患者復(fù)發(fā)外，其他患者均正常，未見復(fù)發(fā)。

基于以上腫瘤細(xì)胞過繼免疫治療的研究進(jìn)展，我們開展DC/CIK過繼細(xì)胞免疫治療自體造血干細(xì)胞移植后完全緩解血液腫瘤的臨床安全性研究，觀察其治療過程中及治療后的不良反應(yīng)。臨床研究在DC/CIK在治療過程中及治療后主要的不良反應(yīng)是低熱、疲乏無力、注射部位輕微疼痛等。低熱多發(fā)生在輸注完2 h左右，持續(xù)2～6 h左右，可自行緩解，疼痛亦可自行緩解。DC/CIK治療后患者的外周血、肝腎功能、心肌酶等血液生化指標(biāo)不受治療影響。在治療過程中觀察患者生命體征平穩(wěn)，無危及生命的并發(fā)癥出現(xiàn)。未見食欲減退等癥狀，患者精神狀態(tài)較好。DC/CIK治療不良反應(yīng)少，臨床治療是安全的。

［1］ 隋承光，孟凡東，王曉華，等.CIK的制作及對不同腫瘤細(xì)胞株體外抗腫瘤作用的研究.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，34(3):210.

［2］ Jonathan S.Serody，Edward J.Collins，Roland M.Tisch，et al.T Cell Activity After Dendritic Cell Vaccination Is Dependent on Both the Type of Antigen and the Mode of Delivery.The Journal of Immunology，2000，164:4961-4967.

［3］ Lawrence Fong，Dirk Brockstedt，Claudia Benike，et al.Dendritic Cell-Based Xenoantigen Vaccination for Prostate Cancer Immunotherapy.The Journal of Immunology，2001，167:7150-7156.

［4］ 岳欣，李慧，于津浦，等.不同輸注途徑對CIK細(xì)胞治療后的體內(nèi)分布的影響.中國免疫學(xué)雜志，2007，23(3):224-228.

［5］ Reichart V L，Okada C Y，Liso A，et al.Idiotype vaccination using dendritic autologous periphereal blood stem cell transplantion for multipe myeloma a feasibility study.Blood，1999，9397:2411-2419.

［6］ 張樂萍，陸愛東，童春容，等.細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞/白細(xì)胞介素2治療兒童急性淋巴細(xì)胞白血病微小殘留病灶療效觀察.實(shí)用兒科臨床雜志，2003，18(3):185-186.

［7］ 石永進(jìn)，虞積仁，朱平，等.細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷(CIK)細(xì)胞的大容量擴(kuò)增與殺傷活性觀察.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2001，18(1):94-96.

512026汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院