成骨細(xì)胞中基因表達(dá)的調(diào)控

靳 慧 葛婭娜 張成仁 許 野 朱蘭蘭 王秀梅

成骨細(xì)胞中基因表達(dá)的調(diào)控

靳 慧 葛婭娜 張成仁 許 野 朱蘭蘭 王秀梅＊

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔內(nèi)科，黑龍江150086）

在骨骼發(fā)生、重塑和再生過(guò)程中，成骨細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞基質(zhì)蛋白和基質(zhì)礦化的調(diào)節(jié)因子，它們來(lái)自于間葉細(xì)胞的前體細(xì)胞，隨著成骨細(xì)胞的發(fā)生、增殖和分化，這些細(xì)胞因子經(jīng)歷了一個(gè)基因表達(dá)的過(guò)程。成熟的成骨細(xì)胞產(chǎn)生特征性的細(xì)胞外膠原基質(zhì)，隨后被羥灰石晶體礦化。除了一些基本功能外，礦化骨是鈣和磷的主要載體，還有造血的功能。人類的一些疾病如骨質(zhì)疏松癥、關(guān)節(jié)炎、骨腫瘤等會(huì)導(dǎo)致骨量減少、骨密度降低。成骨細(xì)胞形成和修復(fù)是整形外科以及牙科修復(fù)治療的基礎(chǔ)。理解成骨細(xì)胞形成的細(xì)胞和分子機(jī)制對(duì)于更好的治療這些疾病是非常重要的。

成骨細(xì)胞；基因表達(dá)；調(diào)控

骨骼發(fā)育是一個(gè)由相應(yīng)間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞系和軟骨細(xì)胞系演變的過(guò)程，以及這些前體細(xì)胞依次向骨祖細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞終末分化。骨祖細(xì)胞經(jīng)歷了一個(gè)擴(kuò)增階段，以諸如組蛋白、纖維連接蛋白、Ⅰ型膠原、c-fos、c-Jun和 P21等蛋白的產(chǎn)生為特征［1］。隨后，當(dāng)它們開始生產(chǎn)和使成骨細(xì)胞基質(zhì)成熟時(shí)退出有絲分裂，過(guò)渡到進(jìn)行表達(dá)基因。例如：堿性磷酸酶、涎蛋白和Ⅰ型膠原［2］。最后，它們表達(dá)的基因涉及到細(xì)胞基質(zhì)的礦化，例如：骨鈣蛋白、骨橋蛋白和膠原酶。這在很大程度上表明了基因表達(dá)和細(xì)胞分化的程序是由包括Runx2、osterix、SMADs、NFATc1、和 ATF-4在內(nèi)的一系列轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和活化所管理的。這些因子并不是孤立存在的，而是相互作用，形成一個(gè)完整的、各種各樣的、和諧的信號(hào)及基因調(diào)控通路。除了上述轉(zhuǎn)錄因子，最近發(fā)現(xiàn)的MicroRNA也是成骨細(xì)胞的基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子?，F(xiàn)將各個(gè)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于基因表達(dá)的作用以及最新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子分別做一個(gè)介紹。

1.Runx2

Runx2被描述為成骨細(xì)胞分化的主要調(diào)節(jié)因子［3］。它在成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)、復(fù)制和成熟整個(gè)過(guò)程中都會(huì)起作用，并且調(diào)節(jié)許多成骨細(xì)胞基因的表達(dá)。許多影響成骨細(xì)胞分化的信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子都是通過(guò)影響Runx2的產(chǎn)生和活化來(lái)調(diào)節(jié)的。單純性的Runx2過(guò)表達(dá)會(huì)引起顱骨鎖骨發(fā)育異常綜合癥。這是一種以鎖骨發(fā)育障礙、各種類型的牙齒缺陷、顱骨骨化延遲以及許多其他骨骼異常為特征的疾病。而同型Runx2基因突變的小鼠是無(wú)法存活的，因?yàn)橐幌盗械牡V化骨的缺乏導(dǎo)致其成骨細(xì)胞分化障礙［4］。Runx2的表達(dá)與其靶基因的表達(dá)聯(lián)系不太密切，這表明Runx2的活化也受其他因子調(diào)控。除了它的Runx2蛋白還包括許多結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域通過(guò)與輔酶激活物或輔阻遏物結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性或阻遏物［5-6］。這些控制方式使Runx2對(duì)成骨細(xì)胞分化起到主要調(diào)節(jié)作用，它整合各種不同的信號(hào)通路以一種短暫精確的方式或激活、或阻遏轉(zhuǎn)錄因子，并根據(jù)生理需要做相應(yīng)的改變。

最近的一些報(bào)道強(qiáng)調(diào)控制Runx2功能的因子和機(jī)制。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，例如p300、CBP、PCAF和 MORF 都是 Runx2的輔 激 活 物［7，8］。它們將乙?；Y(jié)合到組蛋白和非組蛋白的靶基因的賴氨酸殘基上，通過(guò)一系列機(jī)制包括改變蛋白-蛋白之間的相互作用以及改變蛋白的穩(wěn)定性來(lái)改變蛋白質(zhì)的功能。在組蛋白核小體中，乙?；饔门c另一個(gè)更開放的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)以及位點(diǎn)上增長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄活性相聯(lián)系。對(duì)Runx2和HDACs之間的相互關(guān)系的發(fā)現(xiàn)首次證明了組蛋白脫乙酰酶抑制劑降低了一些Runx2阻遏結(jié)構(gòu)域的活性。人們使用候選基因檢測(cè)的方法表明了HDAC6結(jié)合Runx2并且阻遏其活性［9］。隨后的研 究表明結(jié)合的 Runx2被HDAC3、HDAC4、HDAC5和 HDAC7功能性抑制［10-15］。

小分子抑制劑的HDACs的抑制作用或RNA介導(dǎo)的抑制作用加速體外成骨細(xì)胞分化，這表明HDACs可能會(huì)成為臨床上治療骨代謝疾病的相關(guān)靶點(diǎn)［16-18］。人們認(rèn)為 HDAC蛋白可形成多元素的復(fù)合抑制物，這些復(fù)合抑制物由一些輔因子組成，例如 NCOR、SMRT 和 SIN3a，也 包 括 多 樣 的HDACs.雖然我們已經(jīng)弄清楚Runx2基因的表達(dá)是通過(guò)HDACs獨(dú)特的機(jī)制進(jìn)行抑制的，并對(duì)不同的成骨信號(hào)做出了反應(yīng)，但是這些復(fù)合物如何參與調(diào)節(jié)Runx2的活性，我們?nèi)圆坏枚?。Lamour等人表明Runx2招募HDAC3作為BSP的啟動(dòng)子，這個(gè)啟動(dòng)子通過(guò)脫乙?；M蛋白抑制其轉(zhuǎn)錄［19］。Jeon等發(fā)現(xiàn)BMP2由SMAD依賴機(jī)制通過(guò)刺激Runx2的乙?；饔脕?lái)保護(hù)Runx2免遭Smurf1催化的蛋白水解作用。P300引起的Runx2乙?；cHDAC4和HDAC5相對(duì)抗，這二者使乙?；鶊F(tuán)遠(yuǎn)離Runx2，從而促進(jìn)Runx2介導(dǎo)的蛋白水解作用。有趣的是，雌激素受體相關(guān)受體γ是一個(gè)表達(dá)在成骨細(xì)胞上的孤獨(dú)基因核受體，由BMP2所刺激，它與P300競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合Runx2并且抑制BMP2誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞形成。Runx2招募HDAC6和HDAC7到染色質(zhì)上，然而，這些因子利用獨(dú)特的、還不完全清楚的機(jī)制來(lái)抑制Runx2靶基因的轉(zhuǎn)錄。HDAC6可以減弱乙酰酶抑制劑的抑制作用，而HDAC7抑制Runx2的機(jī)制目前還不十分清楚。BMP2可激活蛋白激酶D1，蛋白激酶D1使HDAC7磷酸化，導(dǎo)致其從細(xì)胞核內(nèi)暫時(shí)性游出并保護(hù)Runx2免遭HDAC7 的 抑 制［20］。 盡 管 HDAC4、HDAC5 和HDAC7的蛋白結(jié)構(gòu)非常相似，HDAC7似乎并不能影響Runx2的蛋白水平。它們能夠從細(xì)胞核內(nèi)游出以應(yīng)對(duì)蛋白激酶的共同聚集。然而在成骨細(xì)胞樣細(xì)胞中，它們不同的亞細(xì)胞表型分布對(duì)BMP2的刺激有不同的反應(yīng)。因此，盡管我們?cè)诶斫釮DACs在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中所起的作用已取得了很大的進(jìn)步，但對(duì)其調(diào)控機(jī)制目前還不十分清楚。

甲狀旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）是刺激Runx2與乙酰轉(zhuǎn)移酶相互作用的另一種重要的骨骼生理調(diào)節(jié)因子。PTH是成骨細(xì)胞中MMP-13轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)抑制劑［21-22］。PTH對(duì)這些細(xì)胞的刺激導(dǎo)致蛋白激酶A依賴P300結(jié)合Runx2，從而增強(qiáng)組蛋白乙?；突蜣D(zhuǎn)錄［23］。PTH也通過(guò)一些其他機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)Runx2的活性。例如：磷酸化作用［24］以及促進(jìn)與激活蛋白1（activating protein-1，AP-1）轉(zhuǎn)錄因子的相互作用［25］。最后，PTH 通過(guò)泛素介導(dǎo)的蛋白水解作用來(lái)降低Runx2蛋白的穩(wěn)定性，限制PTH對(duì)成骨細(xì)胞基因表達(dá)的刺激。

2.Osterix

與成骨細(xì)胞分化相關(guān)的關(guān)鍵基因Osterix（人類Osterix的同源物也叫specificprotein7，Sp7）是表達(dá)在成骨細(xì)胞上的鋅指轉(zhuǎn)錄因子。和Runx2類似，它也有助于成骨細(xì)胞的形成［26］。研究表明，在Osterix基因敲除小鼠胚胎中，成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志物（Ⅰ型膠原、骨鈣素等）的表達(dá)水平嚴(yán)重降低或缺失。Ⅰ型膠原是成骨細(xì)胞分化最早的標(biāo)志，也是骨基質(zhì)中含量最多的蛋白，在野生小鼠16天的胚胎時(shí)，成骨細(xì)胞Ⅰ型膠原RNA表達(dá)水平明顯高于皮膚中的成纖維細(xì)胞以及間充質(zhì)細(xì)胞，而在Osterix基因敲除小鼠胚胎中，Ⅰ型膠原RNA水平在間充質(zhì)細(xì)胞密集的成骨部位，軟骨膜及軟骨中的表達(dá)均明顯低于野生型小鼠。Osterix缺陷的小鼠由于缺乏礦化骨在出生時(shí)就會(huì)死亡。通過(guò)膜內(nèi)成骨的骨形成是完全的非礦化，而軟骨內(nèi)骨則展示了礦化的軟骨區(qū)，這表明Osterix專門對(duì)成骨細(xì)胞起作用［27］。盡管Osterix表達(dá)調(diào)控對(duì)骨形成的重要機(jī)制還不完全清楚，我們認(rèn)為Osterix是Runx2的下游調(diào)控因子，因?yàn)樵贠sterix缺陷的小鼠中Runx2的表達(dá)是正常的，而在Runx2基因敲除的小鼠中則Osterix表達(dá)缺失。到目前為止，Osterix的功能和調(diào)控的一些細(xì)節(jié)還不十分清楚。

3.ATF4

PSK2是由蘇氨酸激酶突變引起的Coffin-Lowry綜合癥，是包括各種不同的骨骼異常的紊亂綜合癥。在此過(guò)程中，ATF4對(duì)成骨細(xì)胞的作用被識(shí)別。PSK2激酶和ATF4缺陷會(huì)減少骨量生成［28］，而ATF4的強(qiáng)制性積累可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞基因的表達(dá)［29］。在骨鈣蛋白啟動(dòng)子作用下，ATF4和Runx2［30］形成一系列復(fù)合物來(lái)增強(qiáng)骨鈣素的轉(zhuǎn)錄。最近的研究進(jìn)一步表明這個(gè)復(fù)合物由PTH信號(hào)所介導(dǎo)。有趣的是，最近的研究表明成骨細(xì)胞內(nèi)的ATF4通過(guò)改變骨鈣蛋白和瘦蛋白激素通路來(lái)降低胰島素的產(chǎn)生及其應(yīng)答，從而調(diào)控能量的新陳代謝。

4.SMADS

生長(zhǎng)因子家族的骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPS）和 轉(zhuǎn) 化 生 長(zhǎng) 因 子 β（transforming growth factor-β，TGFβ）長(zhǎng)期被認(rèn)為是骨骼生理的重要調(diào)節(jié)因子。TGFβBMP信號(hào)通路導(dǎo)致受體激活SMADS的磷酸化和細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，與DNA直接作用，以及與其他轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)合從而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。rSMADS間充質(zhì)細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)Runx2的表達(dá)進(jìn)入成骨細(xì)胞系［31］，它們也與Runx2蛋白相互作用協(xié)同調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄［32］。Runx2上的SMAD交互結(jié)構(gòu)域被識(shí)別，它與細(xì)胞核靶基質(zhì)序列相連續(xù)，這種結(jié)構(gòu)有利于Runx2行使其功能。最近的研究表明在BMP／SMAD／Runx2信號(hào)通路之間有一個(gè)有趣的反饋回路表明BMPs是通過(guò)Runx2來(lái)誘導(dǎo)SMAD6的表達(dá)，而SMAD6是抑制BMP信號(hào)通路的SMAD蛋白抑制劑。SMAD6通過(guò)Smurf1刺激Runx2泛素化和降解［33］，這個(gè)過(guò)程可能是阻止過(guò)多的BMP／Runx2介導(dǎo)的骨生成的潛在機(jī)制。

5.NFATc1／Calcineurin

NFATc1是在破骨細(xì)胞形成和T細(xì)胞發(fā)展過(guò)程中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子［34］。在沒(méi)有刺激的細(xì)胞中，NFATc1是高度磷酸化的，它位于細(xì)胞質(zhì)上。細(xì)胞內(nèi)的鈣信號(hào)通路激活鈣調(diào)磷酸酶，使NFATc1脫磷酸，允許其細(xì)胞核轉(zhuǎn)入和NFATc1介導(dǎo)的基因表達(dá)。鑒于NFATc1在破骨細(xì)胞分化過(guò)程中的重要性。我們預(yù)測(cè)鈣調(diào)磷酸酶抑制劑可能抑制吸收和增強(qiáng)骨形成。然而事實(shí)上，鈣調(diào)蛋白抑制劑導(dǎo)致骨量減少。Koga等人解決了這個(gè)悖論，證明除了抑制破骨細(xì)胞，鈣調(diào)蛋白抑制劑還通過(guò)阻止在成骨細(xì)胞中NFATc1和Osterix之間的合成途徑來(lái)組織成骨細(xì)胞的成熟和礦化。在隨后的研究中，Choo等人表明過(guò)表達(dá)活化的NFATc1抑制體外M3C3T3成骨細(xì)胞分化，并且作為抑制TCF／LEF轉(zhuǎn)錄活性的結(jié)果，它還降低骨鈣素的表達(dá)。

6.microRNAs調(diào)控的成骨細(xì)胞基因的表達(dá)

MicroRNAs（miRs）對(duì)成骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用是一個(gè)振奮人心的發(fā)現(xiàn)。他們是短的非編碼RNA，核苷酸序列從18到25不等。它們通過(guò)與mRNAs特定靶基因中3＇-UTR結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)?；蛘咭赐ㄟ^(guò)靶向mRNAs的衰退，要么通過(guò)抑制其轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制基因的表達(dá)［35］。許多miRs都是通過(guò)抑制成骨細(xì)胞的基因來(lái)抑制成骨細(xì)胞分化的。Li等人發(fā)現(xiàn)了BMP-2促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的最新的機(jī)制［36］。通過(guò)RNA的表達(dá)復(fù)制，他們識(shí)別了一系列miRs，這些miRs通過(guò)多潛能間充質(zhì)干細(xì)胞C2C12刺激BMP2來(lái)降低表達(dá)。人們預(yù)測(cè)miRs阻止了一系列前成骨細(xì)胞因子的表達(dá)。這樣，miRs水平應(yīng)該提高成骨細(xì)胞基因的表達(dá)。成骨細(xì)胞的擴(kuò)增受miRs的抑制。主要是抑制ErbB2受體絡(luò)氨酸激酶［37］。我們已經(jīng)識(shí)別了兩種抑制成骨細(xì)胞中Dlx5表達(dá)的miRs，miR-29a和miR-29c被表達(dá)用來(lái)抑制細(xì)胞外基質(zhì)骨連蛋白的表達(dá)［38］，后者對(duì)骨骼的生理過(guò)程是非常重要的［39］。并不是所有的miRs都是成骨細(xì)胞分化過(guò)程中的抑制劑。TGFβ信號(hào)通路抑制骨生成，而miR通過(guò)抑制Acvr1b（TGFβ的一種類型的受體）對(duì)成骨細(xì)胞的分化起正面調(diào)節(jié)作用［40］。

總之，近年來(lái)我們?cè)谧R(shí)別成骨細(xì)胞中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的蛋白及其調(diào)控機(jī)制方面取得了很大的進(jìn)步。基因表達(dá)的調(diào)控和蛋白活性是由不同因素協(xié)調(diào)控制的，這些發(fā)現(xiàn)為我們臨床上治療骨代謝疾病提供了新思路，對(duì)原有治療方法的改進(jìn)也起到了很好的參考作用。

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R349.64

A

10.3870／zgzzhx.2011.05.016

2011-02-10

2011-04-01

黑龍江省政府博士后啟動(dòng)基金（LRB05-279）

靳 慧，女（1984年），漢族，碩士。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）