乳酸菌酸脅迫應(yīng)答機制研究進(jìn)展

文 / 金君華 張 昊 郭慧媛 任發(fā)政 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部功能乳品重點實驗室

1 概述

乳酸菌的特點是在其生長發(fā)酵時產(chǎn)生酸性的終產(chǎn)物，這些終產(chǎn)物的積累會改變其生長的外環(huán)境，使一些微生物難以適應(yīng)，但乳酸菌可以依然存活。這一特點是許多食物可以通過發(fā)酵來保存的依據(jù)。另外，進(jìn)入消化道后，乳酸菌要遭遇胃的酸性環(huán)境。但除了一些種屬外，如Lactobacillus，Leuconostoc和Oenococcus，乳酸菌都是嗜中性的，生長最適pH值在5～9之間。因此，人們對乳酸菌的耐酸性產(chǎn)生了極大的興趣。目前，有關(guān)乳酸菌酸脅迫應(yīng)答機制的研究正在深入開展中。

2 乳酸菌的耐酸應(yīng)答

已有的研究表明，至少有兩種不同的生理狀態(tài)可以提高乳酸菌的耐酸性。第一種是在對數(shù)生長期，通過非致死的pH值誘導(dǎo)產(chǎn)生耐酸應(yīng)答（Acid tolerance response of lactobacillus，L-ATR）以提高耐酸性[1～4]；第二種是在進(jìn)入穩(wěn)定期后產(chǎn)生一般的脅迫應(yīng)答（General stress response，GSR），提高耐酸性[5]。雖然在L.acidophilus CRL639中，需要較低的外界pH值才能產(chǎn)生GSR，但一般情況下GSR不依賴于外界環(huán)境的pH值。菌體形成生物膜可能是提高耐酸性的第3 種狀態(tài)，但這僅在變異鏈球菌中有報道[6～7]。大部分乳酸菌（除了L. lactis ssp. cremoris[8]）都擁有L-ATR能力，能夠通過這種應(yīng)答能力來提高菌體在致死酸性環(huán)境中的存活力[2～4]。一般情況下，誘導(dǎo)的L-ATR不僅可以提高乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）的酸耐受性，還可以應(yīng)對其它脅迫，例如高熱、高滲透壓或氧激[1]。L-ATR的這種寬范圍保護(hù)作用在不同種屬之間是不同的，對相同的脅迫不會都具有保護(hù)作用[9]。在L-ATR后，LAB的L-ATR的蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，在L-ATR后，LAB所表達(dá)蛋白質(zhì)的數(shù)目增多[10]，但是只有很少一部分假定的耐酸相關(guān)蛋白質(zhì)被定性地研究過。

目前，已經(jīng)在L.lactis 和S.mutans中開展了耐酸性的基因水平研究，得到了酸敏感突變株，并找到了酸調(diào)節(jié)啟動子；還通過基因手段實現(xiàn)了耐酸突變株的篩選?？傊?，生物化學(xué)、蛋白組學(xué)和基因分析表明，LAB的L-ATR是一個復(fù)雜的過程，它涉及到許多種蛋白質(zhì)的合成和多種機制。

3 耐酸應(yīng)答機制

3.1 維持胞內(nèi)外pH值平衡

3.1.1 依靠ATP的質(zhì)子輸出

如前所述，酸脅迫會導(dǎo)致橫跨膜pH值梯度的減小。LAB能夠在低pH值環(huán)境中維持一種寬范圍的△pH。一些乳酸菌，包括Lactococci可以維持其內(nèi)部pH值接近中性，直到外界pH值下降到某閾值以下，內(nèi)部pH值才開始下降。與其它LAB不同，L.delbrueckii細(xì)胞內(nèi)的pH值與細(xì)胞外pH值同時下降，但維持胞內(nèi)外△pH為1[1]。

（1）F0F1-ATPase

F0F1-ATPase在細(xì)菌中普遍存在，但還并不清楚它的分子結(jié)構(gòu)和操縱子。該多聚體酶既能夠利用質(zhì)子合成ATP，又能利用ATP水解提供的能量將質(zhì)子運送出細(xì)胞。在LAB中，后者活性在低pH值環(huán)境中會升高，這對于維持△pH是至關(guān)重要的[1]。有研究表明，具有一定酸耐受性的Bifidobacterium lactis 和Bifidobacterium animalis，在較低pH值條件下H+-ATPase活性顯著增高[4]。目前已獲得許多F0F1-ATPase活性有缺陷的LAB突變株，并且這些突變株在低pH值環(huán)境中都表現(xiàn)出生長缺陷[1]。最近的研究表明，F(xiàn)0F1-ATPase除了具有電子轉(zhuǎn)移活性外，對于L.lactis的正常生長也很重要[11]。然而，F(xiàn)0F1-ATPase的活性具有一個缺點：它是消耗能量的，這最終可能將阻礙菌體在低pH值條件下的生長[12]。

目前，已有學(xué)者研究過編碼這種酶的一些操縱子（Operon）。ATP位點包含編碼細(xì)胞質(zhì)F1復(fù)合物的5 個亞基（α，β，δ，γ，ε）及形成F0膜質(zhì)子通道的3 個亞基（a，b，c）。在LAB中，atp操縱子具有與其它細(xì)菌不同的基因組成[1]，然而，這種差異的顯著性還不知道。在低pH值中，F(xiàn)0F1-ATPase活性的刺激可能是由于atp位點的轉(zhuǎn)錄子積累造成的（這在L.acidophilus和口腔鏈球菌研究中有報道），也可能是構(gòu)成酶的亞基的穩(wěn)定性造成的（這在E.hirae中有報道）。在所有的LAB研究中，L-ATR的2D蛋白質(zhì)組學(xué)分析均表明，胞質(zhì)F1復(fù)合物所有或部分亞基都呈現(xiàn)了上調(diào)表達(dá)[10]。但是在Oenococcus oeni中，ATPase的活性在低pH值中沒有顯著性地增加，但ATPase突變株的酸耐受性發(fā)生了改變。初步的結(jié)果表明，存在多個不同最適pH值的ATPase[13]。

（2）K+-ATPase

陽離子轉(zhuǎn)運ATPase，例如K+-ATPase在維持pH值的平衡中具有作用[1]。K+和H+的交換能夠使K+-ATPase產(chǎn)生的橫跨膜電勢（△?）轉(zhuǎn)化為橫跨膜pH值梯度（△pH）。這種離子的交換允許建立△pH，并且能夠參與到pH值平衡維持中。例如，生長在pH值為5.0的Streptococcus mutans中，葡萄糖供能的細(xì)胞能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)pH值維持在5.5或者6.1。

3.1.2 基礎(chǔ)化合物的產(chǎn)生

（1）精氨酸脫氨基酶

pH值平衡的另一個機制就是精氨酸脫氨基酶途徑（Arginine deiminase pathway，ADI）。有3 種酶，即精氨酸脫氨基酶、鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶和氨基甲酸酯激酶構(gòu)成了這個途徑，使精氨酸向鳥氨酸、氨水和二氧化碳轉(zhuǎn)化，并且1 mol精氨酸可形成1 mol ATP。生成的NH3與H+發(fā)生反應(yīng)，利于堿化環(huán)境，產(chǎn)生的ATP能夠使F0F1-ATPase將質(zhì)子運送出細(xì)胞外。另外，精氨酸/鳥氨酸的逆向轉(zhuǎn)運子允許這2 個分子在沒有任何能量消耗的狀態(tài)下實現(xiàn)交換。Marquis等人發(fā)現(xiàn)，在有45 mM的精氨酸存在時，L.lactis可以在幾個小時內(nèi)將胞外的pH值從4.0提高到6.5[1]。ADI在許多LAB中都能檢測到，但是對于耐酸性的直接影響還沒有被報道。另外，已有研究顯示，與ADI調(diào)節(jié)直接相關(guān)的刺激因子應(yīng)該是精氨酸的存在，能量的消耗，新陳代謝受到抑制，以及氧化作用[14～15]，而不是低pH值。因此，盡管ADI活性能夠堿化環(huán)境，但在不同菌種中，它對LAB耐酸性的重要性是不同的。

（2）脲酶

脲酶的活性可以在牛奶S.thermophilus和口腔細(xì)菌S.salivarius中檢測到。既然尿素在唾液中存在，那么尿素的分解對于S.salivarius在極端酸性環(huán)境中的生存就可能尤為重要，因此主要在后者中開展脲酶的研究。脲酶能夠催化尿素水解為CO2和氨水，這樣可以堿化環(huán)境，提高pH值。在有25 mM尿素存在的條件下，pH值3.0的細(xì)胞能夠?qū)⑼饨鏿H值提高到7.6，相對于沒有尿素的處理組，其存活率可提高1 000 倍[16]。通過過量消耗碳水化合物，復(fù)雜的尿素操縱子可以在低pH值環(huán)境中脫除阻遏。

（3）脫羧反應(yīng)和電子轉(zhuǎn)運

在LAB中發(fā)現(xiàn)，脫羧反應(yīng)和電子轉(zhuǎn)運的一些系統(tǒng)對于維持pH值平衡具有作用。在一些反應(yīng)中，1 個羧基酸化合物（比如氨基酸）被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞中，然后被脫羧。在反應(yīng)中，1 個質(zhì)子被消耗，然后產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)運子被輸出細(xì)胞。這個反應(yīng)最后可提高細(xì)胞質(zhì)中的堿性。另外，通過脫羧反應(yīng)和1 個電子轉(zhuǎn)運子可形成質(zhì)子動力勢（Proton motive torce，PMF）從而產(chǎn)生ATP。這些反應(yīng)與耐酸性的關(guān)系是在L.lactis中的谷氨酸脫羧酶（Glutamic acid decarboxylase，Gad）系統(tǒng)中建立出的。在氯化物和葡萄糖存在時，1 個gad缺失突變株的酸敏感性是野生株的1 000 倍[17]。Gad在腸道原核生物中是很常見的。有學(xué)者假設(shè)過這種酶的存在可使細(xì)菌通過胃環(huán)境時變得強大[18]。

蘋果乳酸發(fā)酵是雙羧基蘋果酸與單羧基乳酸之間的轉(zhuǎn)換。細(xì)菌產(chǎn)生的L-乳酸是通過乳酸-蘋果酸反向轉(zhuǎn)運子或電子單向轉(zhuǎn)運排出的，后者可以在低pH值中合成ATP。這種ATP產(chǎn)物很可能在O.oeni耐酸性中發(fā)揮作用[19]。

（4）終產(chǎn)物的電子轉(zhuǎn)運

已經(jīng)研究過，L.lactis在中性和低pH值中排出的乳酸。在中性pH值條件下，排出過程是生電的，有利于PMF的產(chǎn)生；在低pH值條件下，這種轉(zhuǎn)運是電中性的，不利于膜電勢的產(chǎn)生。Koebman等人研究表明，L.lactis的F0F1-ATPase失效菌株不能在pH值7.0的培養(yǎng)基中形成菌落。這個發(fā)現(xiàn)表明，在中性pH值條件下，乳酸的排出不能產(chǎn)生足夠的能量來保證細(xì)胞的生長[20]。

3.2 細(xì)胞膜脂肪酸構(gòu)成的變化

細(xì)胞膜很可能是生理脅迫的首要目標(biāo)之一。細(xì)胞膜脂肪酸構(gòu)成的變化是對環(huán)境脅迫的一般性應(yīng)答。在E.coli中，脂肪酸修飾在保護(hù)細(xì)菌免受酸脅迫中發(fā)揮著重要的作用[21]。S.mutans可以對于適應(yīng)酸化環(huán)境的原因之一是細(xì)胞膜上具有含量豐富的單不飽和長鏈脂肪酸，這使得細(xì)胞膜對于質(zhì)子的通透性降低[22]。在S.mutans中，dlt操縱子的失活與脂磷壁酸的D-丙氨酸酯化反應(yīng)有關(guān)，使生長狀態(tài)改變[23]。突變株比野生株更具有酸敏感性，這可能與高質(zhì)子滲透性有關(guān)。在L.lactis中，某個與肽聚糖合成相關(guān)的青霉素綁定蛋白質(zhì)的失活增強了酸敏感性[1]。這些數(shù)據(jù)表明，細(xì)胞壁的組成在酸耐受性上具有一定的影響，很可能是與細(xì)胞表面特性的改變有關(guān)，或者還有有利于維持酸脅迫環(huán)境細(xì)菌細(xì)胞壁完整性的其它系統(tǒng)存在。

首先，在O.oeni中，1 個小的熱激蛋白（smHSP）Lo 18，在熱處理、乙醇處理和酸處理后被誘導(dǎo)。原核生物的smHSP與有脊動物眼睛的α－晶狀體蛋白具有同一個保守序列。脅迫處理被誘導(dǎo)很可能與這個蛋白質(zhì)在其它伴侶蛋白的共同作用下重新折疊成變性蛋白有關(guān)。有趣的是，Lo 18在熱脅迫之后可以變成主要的膜相關(guān)物質(zhì)，可以被膜的流化作用誘導(dǎo)表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明，Lo 18可能與熱脅迫或酸脅迫后膜或壁蛋白的穩(wěn)定性有關(guān)[24]。

第二，S.mutans的Ffh蛋白在耐酸性中發(fā)揮作用。在E.coli中，F(xiàn)fh參與處理膜與胞外蛋白質(zhì)運輸?shù)男盘栕R別粒子（Signal recognization particle，SRP）轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑。在S.mutans中，ffh基因會被低pH值誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。ffh突變株比野生株更具有酸敏感性，并且在酸脅迫中不能夠快速地提高F0F1-ATPase的活性[25～26]。這種表型或許反映了SRP系統(tǒng)在F0F1-ATPase轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用及其它酸誘導(dǎo)蛋白向膜內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。

3.3 受損蛋白質(zhì)的修復(fù)

除了可能發(fā)揮分子伴侶作用的O.oeni中的Lo 18和S.mutans中的Ffh蛋白外，在一些LAB的L-ATR的蛋白組分析中發(fā)現(xiàn)，熱激分子伴侶總是上調(diào)表達(dá)。這些蛋白質(zhì)很可能是修復(fù)酸誘導(dǎo)損壞的蛋白質(zhì)或輔助新合成蛋白質(zhì)的折疊。盡管熱激蛋白DanK和GroEL一般會被鑒定出來，但在不同種屬中，酸誘導(dǎo)的熱激蛋白是不同的[3，10]。對S.mutan中的danK和groE操縱子進(jìn)行的特異性研究結(jié)果表明，低pH值的誘導(dǎo)是由它們普遍的熱激調(diào)節(jié)子HrcA和CtsR中間介導(dǎo)的[5，27]。

3.4 受損DNA的修復(fù)

細(xì)胞內(nèi)的酸化可引起DNA的脫嘌呤或脫嘧啶。這個機制與糖基鍵斷裂后的堿基質(zhì)子化作用有關(guān)。參與堿基缺失的位點稱為堿基缺失位點（AP位點）。在L.lactis中，一個適度的UV輻射可以誘導(dǎo)提高針對多種脅迫的耐受性，包括酸脅迫，并且有4 種蛋白質(zhì)在酸誘導(dǎo)中出現(xiàn)上調(diào)，它們都是由DNA損壞處理誘導(dǎo)的。這表明L-ATR或許含有DNA修復(fù)系統(tǒng)[28]，這種假設(shè)在S.mutans中得到驗證。在S.mutans中，L-ATR通過酸環(huán)境誘導(dǎo)了不依賴RecA的DNA修復(fù)系統(tǒng)，從而提高了菌體DNA對損壞的耐受性[9]。進(jìn)一步研究表明，在低pH值下，野生型和recA缺失菌株S.mutans展現(xiàn)了針對AP位點的核酸內(nèi)切酶活性，并且uvrA基因得到誘導(dǎo)表達(dá)[28]。uvrA突變株啟動完整的L-ATR保護(hù)的能力下降，并且在低pH值條件下，DNA降解的程度更嚴(yán)重一些[29]。Uvr系統(tǒng)是被DNA螺旋變形激活的，然而AP核酸內(nèi)切酶活性通常通過堿基切除處理修復(fù)小的DNA損壞區(qū)域。因此，很可能在酸脅迫中2個系統(tǒng)共同工作。

3.5 耐酸系統(tǒng)的調(diào)節(jié)

雙組分系統(tǒng)通常與細(xì)菌對環(huán)境的適應(yīng)有關(guān)。在L.lactis和L.sakei中，一些雙組分突變株展現(xiàn)了與耐酸相關(guān)的表型。雙組分系統(tǒng)在耐酸性中可能的相關(guān)性是表明酸度外部信號的存在[1]。一項最近的研究表明，S.mutans具有與群體效應(yīng)感受相關(guān)的外部信號系統(tǒng)，這刺激了它的酸耐受性。盡管有能力的刺激因子參與到了信號中，但仍需要另一因子來獲得完整的耐酸誘導(dǎo)。一些胞內(nèi)系統(tǒng)能夠在酸或其它脅迫的耐受性的控制中發(fā)揮一些作用[6]。L.lactis的高親和度磷酸轉(zhuǎn)運子的失效突變株對于H2O2和酸性pH值具有很高的耐受性[30]。很可能像在B.subtilis中研究結(jié)果一樣，磷酸限制誘導(dǎo)了包括脅迫耐受基因的調(diào)節(jié)子[31]。既然之前的研究表明低pH值能夠降低磷酸轉(zhuǎn)運子的活性，那么磷酸控制調(diào)節(jié)子很可能在L-ATR中發(fā)揮著作用。在L.lactis中，與鳥嘌呤核酸代謝有關(guān)的基因guaA（GMP synthetase）和relA[（p）ppGpp synthetase]失活，導(dǎo)致菌株對酸、熱激和葡萄糖營養(yǎng)饑餓耐受性的提高[30]。在S.mutans中，SGP（Streptococcus GTP-Binding protein）蛋白與GTPase的普遍Era亞家族具有同源性，或許與酸耐受性有關(guān)[32～33]。SGP的可能功能之一就是調(diào)節(jié)GTP/GDP系統(tǒng)。值得注意的是，SGP的表達(dá)量和它與膜的相關(guān)性在脅迫的環(huán)境下同時升高。因此，可以提出假設(shè)：作為脅迫感受器的核糖體[34]，可根據(jù)它的活性調(diào)節(jié)（p）ppGPP合成RelA[1]，及感受或調(diào)節(jié)GTP/GDP比例的SGP是進(jìn)行完整調(diào)節(jié)管理的作用者[33]。

4 展望

由于乳酸菌具有的較高的工業(yè)應(yīng)用價值，有關(guān)乳酸菌在各種環(huán)境中的脅迫反應(yīng)機制已成為研究的焦點之一。隨著新技術(shù)在基因和蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域的應(yīng)用，乳酸菌酸脅迫反應(yīng)機制研究將取得更大的進(jìn)展。

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