機(jī)械牽拉誘導(dǎo)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞激活的分子機(jī)制研究進(jìn)展

陳濤 王海燕 陳彩珍 盧健

青少年健康評(píng)價(jià)與運(yùn)動(dòng)干預(yù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華東師范大學(xué)體育與健康學(xué)院（上海 200241）

了解衛(wèi)星細(xì)胞激活過程中的控制因素，有利于設(shè)計(jì)出更好的促進(jìn)骨骼肌發(fā)育和修復(fù)方案，以應(yīng)用到運(yùn)動(dòng)科學(xué)（提高運(yùn)動(dòng)員機(jī)能表現(xiàn)）和健康科學(xué)（特別是肌肉萎縮和Sarcopenia的治療方法）領(lǐng)域。

1 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活

衛(wèi)星細(xì)胞的激活是提供新的肌細(xì)胞核（融合成新的肌纖維或當(dāng)前肌纖維肥大）的第一步，骨骼肌發(fā)育、損傷修復(fù)的過程中同樣需要衛(wèi)星細(xì)胞的激活。在成體骨骼肌中，處于靜息狀態(tài)的衛(wèi)星細(xì)胞只在適當(dāng)?shù)臈l件（損傷、運(yùn)動(dòng)刺激、牽拉或去神經(jīng)）下被激活（進(jìn)入細(xì)胞周期）［1］。激活的衛(wèi)星細(xì)胞移位到損傷位點(diǎn)，進(jìn)行DNA復(fù)制，增殖、分化融合到肌纖維上或形成新的肌纖維，通過這種途徑，肌細(xì)胞核增加，也為骨骼肌肥大奠定基礎(chǔ)。

衛(wèi)星細(xì)胞的激活過程伴隨著復(fù)雜的生物學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制，衛(wèi)星細(xì)胞的活化、增殖和成肌分化是由細(xì)胞連接、細(xì)胞與細(xì)胞外間質(zhì)的相互作用及生長因子決定的，如胰島素樣生長因子1（IGF-1）、成纖維細(xì)胞生長因子（GFF）、肝細(xì)胞生長因子（HGF）、一氧化氮（NO）在肌衛(wèi)星細(xì)胞激活中的信號(hào)作用已被很多研究證實(shí)［2］。

目前國內(nèi)學(xué)者多采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化能力，已取得顯著成果。例如，路睿睿等［3］采用脂多糖刺激體外培養(yǎng)的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，觀察肌衛(wèi)星細(xì)胞產(chǎn)生肝細(xì)胞生長因子及肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化的變化，發(fā)現(xiàn)脂多糖可誘導(dǎo)肌衛(wèi)星細(xì)胞自分泌肝細(xì)胞生長因子，并促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化。邵素霞等［4］研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞生長因子對(duì)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞具有較強(qiáng)的促增殖作用。

國外學(xué)者則多從分子水平的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路入手，研究HGF等生長因子對(duì)肌衛(wèi)星細(xì)胞的生物學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制。NO-HGF-c-met通路被認(rèn)為是衛(wèi)星細(xì)胞激活過程中非常重要的一條信號(hào)通路，因?yàn)樵诒姸嗟纳L因子中，HGF是唯一一個(gè)能把安靜狀態(tài)下的衛(wèi)星細(xì)胞激活并促進(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞周期的生長因子［5，6］。

2 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞激活過程中的關(guān)鍵因子

2.1 HGF

HGF因?qū)Ω渭?xì)胞具有很強(qiáng)的絲裂原作用而被命名為肝細(xì)胞生長因子［7］。1987年，Stoker等［8］發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞分泌一種能促進(jìn)上皮細(xì)胞集落擴(kuò)散的細(xì)胞因子，稱為離散因子（SF），后來研究發(fā)現(xiàn)SF即HGF［9］，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)HGF/SF作為一種多效能的細(xì)胞因子，在許多細(xì)胞和組織中發(fā)揮促細(xì)胞發(fā)育和分化的作用。HGF/SF的信號(hào)作用是由原癌基因c-met編碼的跨膜受體蛋白所介導(dǎo)的［10］。Jennische［11］等在再生的骨骼肌中檢測到 HGF mRNA，第一個(gè)將HGF與骨骼肌聯(lián)系起來。而后Tatsumi等［5］在安靜和激活狀態(tài)下的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞膜上均發(fā)現(xiàn)了HGF及其受體c-met。轉(zhuǎn)基因小鼠過度表達(dá)HGF會(huì)導(dǎo)致骨骼肌異位發(fā)育，提示HGF在骨骼肌發(fā)育的過程中具有生理上的分散作用［12］。此外，Bladt等發(fā)現(xiàn)c-met突變小鼠不能形成正常的骨骼肌群［13］。1995年Allen等發(fā)現(xiàn)HGF激活大鼠離體骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，促使其進(jìn)入細(xì)胞周期［6］。1998年Tatsumi也證實(shí)在大鼠骨骼肌中，HGF通過其受體c-met能激活衛(wèi)星細(xì)胞［5］。此后一系列包括對(duì)培養(yǎng)離體肌原細(xì)胞、單根肌纖維及活體骨骼肌的研究均證實(shí)HGF通過與衛(wèi)星細(xì)胞膜上的c-met結(jié)合激活衛(wèi)星細(xì)胞［14，15］。一般情況下，HGF位于肌細(xì)胞外區(qū)域，有可能與細(xì)胞外基質(zhì)主要組成部分——蛋白聚糖連接在一起，當(dāng)骨骼肌損傷時(shí)，HGF能快速從細(xì)胞外基質(zhì)釋放出來并與衛(wèi)星細(xì)胞膜上的 c-met結(jié)合，激活衛(wèi)星細(xì)胞［5，16］。

2.2 NO

內(nèi)源性NO是在一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）和還原型尼克酰胺嘌呤二核苷酸（ANPDH）的共同作用下，利用L-Arg和活性分子氧生成的。NOS在多種細(xì)胞中均有表達(dá)，目前已確定有3種NOS同工酶，分別是神經(jīng)原型（neuronal-NOS，nNOS）、內(nèi)皮型（endothelial-NOS，eNOS）和誘導(dǎo)型（inducible-NOS，iNOS）［17］。骨骼肌中主要表達(dá)nNOS，Ⅰ型和Ⅱ型肌纖維中均有nNOS表達(dá)，nNOS通過與抗肌萎縮蛋白-糖蛋白復(fù)合體結(jié)合分布在骨骼肌細(xì)胞膜上［18］。正常情況下，骨骼肌中的NO處于非常低的水平，衛(wèi)星細(xì)胞也處于安靜狀態(tài)，在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練、負(fù)重、損傷、剪切應(yīng)力或機(jī)械牽拉的刺激下，NOS的表達(dá)或活性增加［19］。2000 年 Anderson［15］研究證實(shí)擠壓損傷的骨骼肌中，NO的快速釋放是誘導(dǎo)衛(wèi)星細(xì)胞肥大并脫離其毗鄰衛(wèi)星細(xì)胞的關(guān)鍵。2002年Anderson等［16］又通過離體培養(yǎng)單根肌纖維發(fā)現(xiàn)，NO可以激活安靜狀態(tài)下的衛(wèi)星細(xì)胞，阻斷NO的合成，也阻斷了衛(wèi)星細(xì)胞的激活。

3 機(jī)械牽拉刺激骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞激活的信號(hào)通路

3.1 HGF與骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞激活

Tatsumi等［20］采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，利用真空負(fù)壓牽拉刺激，從9月齡SD大鼠骨骼肌中分離出安靜狀態(tài)下的衛(wèi)星細(xì)胞，牽拉刺激12、24、48小時(shí)后發(fā)現(xiàn)，激活狀態(tài)的衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量顯著增加，與HGF激活離體大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的情況一致［20，21］，使用HGF阻滯劑可以降低機(jī)械牽拉誘導(dǎo)的衛(wèi)星細(xì)胞激活的數(shù)量。其后發(fā)現(xiàn)2小時(shí)的牽拉即可誘導(dǎo)衛(wèi)星細(xì)胞的激活，且抑制HGF的活性，發(fā)現(xiàn)衛(wèi)星細(xì)胞的激活數(shù)量明顯減少，幾乎與對(duì)照組無差異。對(duì)牽拉2小時(shí)組培養(yǎng)基進(jìn)行免疫印跡檢測，發(fā)現(xiàn)具有活性的HGF，并且其能夠激活未牽拉組衛(wèi)星細(xì)胞。為了確定HGF的來源及HGF是否定位在c-met呈陽性的衛(wèi)星細(xì)胞上，Tatsumi［20］等又使用了免疫熒光雙標(biāo)記技術(shù)，結(jié)果證實(shí)HGF主要集中在細(xì)胞膜表面。使用1.0M濃度的NaCl洗滌牽拉12小時(shí)組的衛(wèi)星細(xì)胞以去除細(xì)胞外的HGF，牽拉誘導(dǎo)的激活作用消失，繼續(xù)牽拉刺激該組發(fā)現(xiàn)，衛(wèi)星細(xì)胞依然可被內(nèi)源性的HGF激活。這些研究為牽拉刺激誘導(dǎo)的衛(wèi)星細(xì)胞激活作用是通過細(xì)胞外基質(zhì)HGF釋放實(shí)現(xiàn)的提供了有力的證據(jù)。

3.2 NO與骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞激活

為了研究NO在HGF釋放過程中的作用，Tatsumi等［21，22］通過添加NOS抑制劑 （L-NAME），發(fā)現(xiàn)牽拉刺激衛(wèi)星細(xì)胞的激活作用消失，增加HGF可以使這種激活作用得到恢復(fù)，說明L-NAME并非直接抑制衛(wèi)星細(xì)胞的激活，而是通過抑制HGF從而抑制衛(wèi)星細(xì)胞的激活。用免疫印跡法檢測該組培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)HGF并未釋放出來。此外，給非牽拉組添加亞硝基五氰絡(luò)鐵酸鈉二水化合物（一種NO供體），發(fā)現(xiàn)衛(wèi)星細(xì)胞激活的速度增加，用免疫印跡法檢測培養(yǎng)基，也能檢測出HGF。這些結(jié)果表明，機(jī)械牽拉作用誘導(dǎo)的HGF從其細(xì)胞外基質(zhì)儲(chǔ)存庫中的釋放依賴NO的生成［22］。

3.3 MMP與骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞激活

2006年，Yamada等［23］發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬酶蛋白（MMPs）介導(dǎo)了NO誘導(dǎo)的HGF釋放。MMPs的活性受到抑制的情況下，可阻斷HGF的釋放和后繼的衛(wèi)星細(xì)胞的激活。MMPs是一個(gè)鋅依賴的肽鏈內(nèi)切酶大家族，目前已明確其有25個(gè)家族成員，均有一個(gè)前肽區(qū)和一個(gè)包含鋅離子的催化區(qū)域。作為肽鏈內(nèi)切酶，其家族成員可以降解數(shù)種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，如膠原蛋白、彈力蛋白、纖維結(jié)合蛋白、蛋白聚糖等［24］。MMP-2、3、7和9在骨骼肌中均有表達(dá)［25，26］，其中 MMP2、3、9 可以裂解硫酸類肝素蛋白多糖的核心蛋白，這些金屬蛋白酶可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的完整和組成，在骨骼肌發(fā)育和修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用［25］。NO可直接亞硝基化MMP，調(diào)節(jié)其活性。此外，有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，NO可上調(diào)MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)水平和酶活性。2008年，Yamada等［26］在對(duì)離體培養(yǎng)的大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞施以30μM亞硝基鐵氰化鈉（一種NO供體）或機(jī)械牽拉2小時(shí)的過程中，發(fā)現(xiàn)非活性的MMP-2前體（72 kDa）轉(zhuǎn)變成了成熟體（52 kDa），在加入NOS抑制劑L-NAME 10μM后，這種轉(zhuǎn)變同樣被抑制。在非牽拉組中，添加1μMNOC-7（可以自發(fā)生成NO），發(fā)現(xiàn)重組的MMP-2蛋白轉(zhuǎn)化為成熟體MMP-2（52 kDa），免疫印跡檢測該組培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)HGF。因此可以推測NO激活的MMP2也許介導(dǎo)了HGF從細(xì)胞外基質(zhì)中的釋放，從而激活衛(wèi)星細(xì)胞。

2009年，Tatsumi［27］等發(fā)現(xiàn)鈣 -鈣調(diào)蛋白同樣可以誘導(dǎo)HGF的釋放并激活衛(wèi)星細(xì)胞，并且可能在NO合成過程中起到一種信號(hào)作用。在體外培養(yǎng)的衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)基中添加鈣離子載體，2小時(shí)后HGF釋放并激活衛(wèi)星細(xì)胞，這種效果與機(jī)械牽拉或添加NO供體一樣。添加鈣調(diào)蛋白抑制劑可以消除這種激活作用。該研究結(jié)果提示，可能是鈣-鈣調(diào)蛋白通過激活NO的合成介導(dǎo)了細(xì)胞外基質(zhì)釋放HGF，從而激活衛(wèi)星細(xì)胞。

綜合以上一系列研究，可將NO依賴的衛(wèi)星細(xì)胞激活信號(hào)通路歸納如下，即衛(wèi)星細(xì)胞激活的分子機(jī)制是一系列分子級(jí)聯(lián)應(yīng)答反應(yīng)的結(jié)果，包括鈣-鈣調(diào)蛋白的形成、NOS的激活、NO的生成、MMP的激活、HGF的釋放、HGF與其受體c-met的結(jié)合等。

4 總結(jié)

衛(wèi)星細(xì)胞是出生后骨骼肌中固有的、具有增殖分化潛能的肌源性干細(xì)胞，大部分處于靜息狀態(tài)。當(dāng)骨骼肌受到損傷、運(yùn)動(dòng)刺激或機(jī)械牽拉時(shí)，衛(wèi)星細(xì)胞被激活，進(jìn)而增殖、分化，融合到臨近的肌纖維上，以促進(jìn)受損肌纖維修復(fù)再生或運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的骨骼肌肥大。目前的研究結(jié)果表明，機(jī)械刺激觸發(fā)的一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)需要NO-MMP2-HGF-c-met的參與，這可能就是骨骼肌將機(jī)械變化轉(zhuǎn)化為化學(xué)信號(hào)從而激活衛(wèi)星細(xì)胞的分子機(jī)制。當(dāng)然，調(diào)節(jié)衛(wèi)星細(xì)胞機(jī)能的信號(hào)通路還有很多，錯(cuò)綜復(fù)雜，因此需要對(duì)“機(jī)械-生物學(xué)”在骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞激活過程中的作用和機(jī)制進(jìn)行深入研究和理解。

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