MC4R基因研究進(jìn)展

左北瑤，錢宏光

（1.新疆巴州畜牧工作站，庫爾勒 841000；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院）

MC4R（melanocortin-4 receptor，黑素皮質(zhì)素受體-4）是下丘腦腹內(nèi)側(cè)核分泌的一類肽類物質(zhì)［1］，為黑素皮質(zhì)素受體家族5個亞型（MC1-5R）之一。黑素皮質(zhì)素受體是 G-蛋白偶聯(lián)受體（G-protein coupled receptors，GPCRs）超家族的成員，是腺苷酸環(huán)化酶途徑中所有的7個橫跨膜受體，它們的表達(dá)部位和功能都不一樣。MC1R基因被毛色擴(kuò)展基因座所編碼，在黑素細(xì)胞和白細(xì)胞中表達(dá)，分別影響毛發(fā)、羽毛及表皮色素沉積和炎癥的發(fā)生。MC2R僅在腎上腺皮質(zhì)和脂肪細(xì)胞中表達(dá)，其功能是作為促腎上腺皮質(zhì)素的受體，介導(dǎo)腎上腺類固醇生成。MC3R是一個神經(jīng)受體，主要生理功能是調(diào)節(jié)采食行為和能量平衡，對動物體重有顯著影響。MC4R可與腦部分泌的天然內(nèi)源配體α-促黑激素（alpha melanocyte-stimulating hormone，α-MSH）結(jié)合，抑制體重的增加［2］。

在哺乳動物中，MC4R具有介導(dǎo)瘦蛋白（leptin）的功能，是一個調(diào)節(jié)能量平衡與能量動態(tài)平衡的重要信號分子［3］。MC4R可與其內(nèi)源性配體黑素皮質(zhì)素激素（melanocortin，MC）或刺鼠色蛋白（agouti protein，agouti蛋白）和 agouti相關(guān)蛋白（agouti related protein，AGRP）相結(jié)合，從而在控制食欲和體重穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用［3-4］。MC4R的中樞神經(jīng)體重調(diào)節(jié)功能主要為抑制攝食，導(dǎo)致血糖、胰島素和瘦素水平降低，從而減少體脂，降低體重。因此，在人類肥胖研究中MC4R作為重要的調(diào)節(jié)因子倍受關(guān)注。最近有研究表明：MC4R的1 232位點(diǎn)的G→A的突變與綿羊背膘厚度間存在關(guān)聯(lián)，AG和AA型較GG型具有較高的背膘厚度。

1 黑素皮質(zhì)素受體-4（MC4R）結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及生理分布

MC4R由332個氨基酸殘基組成，是跨膜G蛋白耦聯(lián)受體家族的成員之一，具有7次跨膜結(jié)構(gòu)［5］。其蛋白的N-末端在細(xì)胞外、C-末端在細(xì)胞內(nèi)，每兩個跨膜區(qū)形成一個拌區(qū)，MC4R的結(jié)合區(qū)在跨膜區(qū)，通常在第3～5和第7跨膜段內(nèi)?？缒^(qū)是相當(dāng)保守的，在同一類受體中幾乎是相同的。研究表明，N-末端和C-末端的第3跨膜段和第2個胞內(nèi)拌區(qū)是與G蛋白發(fā)生作用的重要位點(diǎn)［6］。在第2、第3胞內(nèi)環(huán)（C2、C3）和羧基末端存在蛋白激酶作用的磷酸化位點(diǎn)。Lagerstrom等［7］發(fā)現(xiàn)MC4R在TM2和TM3之間可以插入金屬鋅，這和其他GPCR相似；通過他們創(chuàng)造的MC4R分子模型發(fā)現(xiàn)TM3的旋轉(zhuǎn)對于MC4R的功能是重要的。結(jié)合位點(diǎn)的改變或氨基酸殘基的不同可能引起MC4R功能的改變。

MC4R大量存在于動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的各個區(qū)域中，包括大腦皮質(zhì)、丘腦、下丘腦、腦干和脊索［8］。1994年，Mountjoy等［9］通過原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)大鼠腦內(nèi)MC4R在下丘腦腹內(nèi)側(cè)核（VMH）和弓狀核、中央隆凸和內(nèi)側(cè)系帶核高密度分布，而在下丘腦背內(nèi)側(cè)核和大腦前區(qū)的分布密度較低，通過限制攝食可上調(diào)上述部位MC4R密度，而通過攝食誘導(dǎo)肥胖可下調(diào)受體密度?？梢?，MC4R是神經(jīng)組織特別是下丘腦中占優(yōu)勢的受體亞型，因此它被認(rèn)為在下丘腦食欲控制過程中起關(guān)鍵作用。

2 黑素皮質(zhì)素受體-4（MC4R）的調(diào)控機(jī)制

2.1 MC4R激動劑

黑素細(xì)胞皮質(zhì)激素（melanocortin，MC）是α-黑素細(xì)胞刺激素（α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH）、β-MSH、γ-MSH和ACTH等相關(guān)肽的總稱，是由大分子多肽前體物質(zhì)——前阿片黑素細(xì)胞皮質(zhì)激素（proopiomelanocortin，POMC）水解后生成的［10］。在小鼠側(cè)腦室中注入α-MSH及其同類物MT-Ⅱ（MC3R和MC4R的強(qiáng)激動劑），可抑制正常空腹和神經(jīng)肽Y（NPY）刺激時的小鼠攝食量增多，也可抑制agouti過度表達(dá)和ob/ob（缺少瘦素）肥胖小鼠的攝食。同時使用α-MSH的拮抗劑SHU9119，則動物的攝食量明顯增加。在小鼠側(cè)腦室內(nèi)注入SHU9119，也可增加其夜間的攝食和空腹的攝食量［11］。對于剔除MC4R基因的小鼠，對抑制食欲的激動劑MT-Ⅱ則無反應(yīng)，證實了內(nèi)源性MSH對攝食的調(diào)節(jié)作用是經(jīng)由MC4R實現(xiàn)的。因α-MSH和MT-Ⅱ皆為非選擇性MCRs的激動劑，Stephen等使用新的選擇性MC4R激動劑Ro27-3225，并且為了防止其他的、非特異性的代謝影響，如胃病，采用了對厭食結(jié)果敏感的行為檢測，發(fā)現(xiàn)大鼠和肥胖db/db小鼠都產(chǎn)生了攝食的劑量依賴性，進(jìn)一步證實了MC4R在食物攝取和體重控制方面的重要性［12］。

2..2 MC4R抑制劑

2.2.1 刺鼠色蛋白（agouti蛋白） 刺鼠色蛋白因一種金黃色皮毛的小鼠而得名，這種小鼠除了皮毛顏色呈金黃色外，10～12周會出現(xiàn)代謝異常，攝食量增加，血糖升高，血清胰島素水平上升，體重增加，并逐漸肥胖，形成小鼠的黃色皮毛肥胖綜合征（the yellow mouse obese syndrome），亦稱Agouti肥胖綜合征。直至1992年，agouti基因被克隆，人們才清楚了其變化的原因。若agouti基因發(fā)生突變，基因結(jié)構(gòu)部分刪除或插入于野生型agouti基因的編碼序列，產(chǎn)生6種顯性agouti等位基因（Ay、Avy、Aiapy、Ahvy、Asy和 Aiy），Raly啟動子占優(yōu)勢，這樣 agouti于全身廣泛表達(dá)，拮抗α-MSH和MC1R的結(jié)合，導(dǎo)致合成脫黑素（pheomelanin），動物皮毛變黃色［13］；拮抗 α-MSH與下丘腦攝食中樞中MC4R的結(jié)合，使小鼠的攝食量比對照組增加10%～36%，產(chǎn)熱減少，對熱卡的利用率上升，并逐漸肥胖（肥胖主要是由于脂肪細(xì)胞的增大），體長也增加［14］。

2.2.2 agouti相關(guān)蛋白（AGRP） AGRP（agouti相關(guān)蛋白）是aguoti的同類物，是MC4R的內(nèi)源性抑制劑，可競爭性拮抗α-MSH對MC3R和MC4R的作用（對MC5R作用很弱），從而增加食欲和攝食量。Yang等［15］通過替換MC1R（AGRP非抑制受體）和MC4R的1、2、3胞外環(huán)的氨基末段，檢測cAMP后證實2、3胞外環(huán)為AGRP結(jié)合部位。Carrie［16］等首次認(rèn)為AGRP除了可以競爭性拮抗α-MSH，還可以直接與MC4R作用，是MC4R的逆向拮抗劑。轉(zhuǎn)基因AGRP過度表達(dá)的動物，在β-actin啟動子控制下，肥胖，體長增加，胰島增大，產(chǎn)生高胰島素血癥和延遲發(fā)生的血糖升高；皮毛的顏色沒有變化，這是因為AGRP作用于MC4R和可能還有MC3R，而不作用于MC1R的緣故；糖皮質(zhì)激素的水平，同agouti廣泛表達(dá)的動物一樣，無明顯的變化［17］。近來，使用具有對MC4R更強(qiáng)選擇性的拮抗劑（如HS104和HS024）增加了飽食大鼠的白晝攝食量，如長期在腦室內(nèi)注入這兩種拮抗劑，隨著攝食量的增加，大鼠的體重逐漸增加而致肥胖［18］。在 MC4R 調(diào)控的研究中，Oosterom 等［19］發(fā)現(xiàn) 268位密碼子Tyr決定了激動劑與拮抗劑的共同選擇性。

3 黑素皮質(zhì)素受體-4（MC4R）基因的研究進(jìn)展

MC4R基因突變在介導(dǎo)肥胖癥發(fā)生中的作用越來越受到人們的關(guān)注。理論上認(rèn)為MC4R基因的突變引起的肥胖癥是由于單倍體不足、顯性負(fù)性效應(yīng)、或者兩者的聯(lián)合作用?，F(xiàn)在各物種關(guān)于MC4R基因的研究已經(jīng)全面展開，并取得了豐碩的研究成果。

1993 年，Gantz等成功克隆出MC4R并將其定位于人染色體18q21.3［20］。人類MC4R編碼基因是一個由996個堿基對構(gòu)成的單一外顯子。隨后，小鼠、大鼠、豬、雞、牛等MC4R基因也相繼被克隆。MC4R基因在各物種中具有高度的同源性。Haegeman等在克隆牛MC4R基因的同時發(fā)現(xiàn)，牛與人、豬、鼠MC4R基因序列相比較，同源性分別為87%、89%和85%［21］?；虻母咄葱蕴崾綧C4R基因及其表達(dá)產(chǎn)物功能的高度保守。

3.1 MC4R基因在人方面的研究進(jìn)展

MC4R是第一個發(fā)現(xiàn)的與人類顯性遺傳疾病性肥胖相關(guān)的靶位點(diǎn)［22］。Yeo等［23］和 Vaisse 等［24］首次在兩例早發(fā)性肥胖患者中發(fā)現(xiàn)了MC4R基因移碼突變后，MC4R在人類能量和體重調(diào)節(jié)中的重要性逐漸地被揭示。人MC4R突變研究表明，其顯性遺傳多由于單體不足所導(dǎo)致，在極少數(shù)個體中也可出現(xiàn)隱性遺傳的錯義突變。MC4R基因突變屬常染色體顯性遺傳，因此該基因具有表型的突變在人群中的發(fā)生率較高，迄今有近80例MC4R基因突變導(dǎo)致肥胖的病例報道［25］，據(jù)估計BMI大于40的極度肥胖人群中有1%～4%是由于MC4R基因突變所致［26］。在人類由MC4R基因突變引起的肥胖癥其表現(xiàn)型多種多樣，除了多食、肥胖外，并不伴發(fā)其他的內(nèi)分泌代謝異常，甲狀腺、腎上腺和生殖功能正常，不同于其他類型的單基因突變性肥胖［27］。另外，MC4R基因多態(tài)性也可能與體脂分布及脂代謝相關(guān)，體型缺陷MC4R導(dǎo)致的肥胖為青少年發(fā)病型，且女性的嚴(yán)重程度高于男性，其中大多數(shù)患者體脂分布有女性化傾向［28］。Rosmond等［28］在瑞典人群中的研究表明，MC4R基因Vall03Ile多態(tài)性與腹內(nèi)脂肪、胰島素水平、血糖水平及脂代謝水平相關(guān)。

3.2 MC4R基因在小鼠方面的研究進(jìn)展

Huszar等（1997）首次證明了MC4R在能量平衡中的關(guān)鍵作用，即敲除MC4R基因（MC4R-/-）的小鼠出現(xiàn)遺傳性肥胖，表現(xiàn)多食、肥胖、胰島素分泌過多等癥狀［29］。具體為第15周時（MC4R-/-）雌性大鼠為同胞正常大鼠MC4R+/+體重的2倍，而雄性則為1.5倍，雜合子MC4R+/-大鼠的體重改變介于MC4R-/-與正常大鼠之間。同時，在敲除小鼠中，高血糖和高胰島素的水平與性別有關(guān)，兩種情況下雄性比雌性形成更快。

3.3 MC4R基因在豬方面的研究進(jìn)展

豬MC4R基因物理定位于1號染色體q22～27處，與豬1號染色體上的數(shù)個標(biāo)記明顯連鎖，用兩點(diǎn)連鎖分析得到的兩個離MC4R基因最近的連鎖標(biāo)記是SO3113（0，17.76）和 S0082（0.05，14.74）［30］。Kim［31］等通過序列比較分析，發(fā)現(xiàn)豬MC4R基因第7跨膜結(jié)構(gòu)功能域的一個高度保守區(qū)內(nèi)一個突變（G→A）導(dǎo)致相應(yīng)的第298位氨基酸發(fā)生了天冬酰胺代替天冬氨酸的錯義突變，并建立了TaqI-PCR-RFLP鑒別豬MC4R基因型方法。對PIC公司5個系的商品豬共1 800頭進(jìn)行分析，顯示MC4R基因型與一些品系的背膘厚和生長率以及所有品系的采食量呈強(qiáng)相關(guān)，AA基因型背膘比BB基因型薄9%，BB基因型比AA基因型日增重高37 g，且差異顯著（P＜0.05）。柳麗華等［32］利用 PCR-RFLP 方法對野豬、杜洛克豬、長白豬，及野豬與杜洛克豬的雜交后代、野豬與長白豬的雜交后代5個群體242頭豬MC4R基因的遺傳變異進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)MC4R基因擴(kuò)增位點(diǎn)存在TaqⅠ多態(tài)性，不過野豬、野豬×長白豬未出現(xiàn)AA基因型，所有群體中C等位基因均以較高頻率存在，野豬最高（0.9167），長白豬最低（0.528 3）。趙曉楓等［33］應(yīng)用 PCR-RFLP 方法對金華豬I系（154頭）、金華豬II系（41頭）、金華豬III系（53頭）的MC4R基因的1 269～1 494 bp區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增，并用TaqI酶進(jìn)行酶切，比較了MC4R酶切后基因型頻率分布情況，結(jié)果表明，AA基因型頻率在金華豬上較高，達(dá) 0.919 4，在 II系中最高，達(dá) 0.951 2，III系次之，達(dá)到0.943 4，I系最低，達(dá)0.902 6，而金華豬的AB基因型和BB基因型頻率都較低，分別為0.056 5和0.024 2。楊曉慧等［34］采用PCR-RFLP技術(shù)對MC4R基因的298位點(diǎn)錯義突變（Asp298Asn）在萊蕪豬、大萊二元雜交豬和商品豬中的多態(tài)性進(jìn)行了檢測，對該突變與商品豬背膘厚的關(guān)系進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明，在33頭萊蕪豬中只檢測到11個基因型，而在大萊二元雜交豬和商品豬中11、12和22基因型均有分布，且等位基因1的頻率均高于等位基因2。商品豬不同基因型個體背膘厚差異顯著（P＜0.05），MC4R基因298位點(diǎn)的Asp298Asn錯義突變與商品豬的背膘厚有關(guān)，可以作為以西方豬種為雜交親本的商品豬背膘厚的分子標(biāo)記。額爾敦達(dá)古拉（2009）采用PCR-RFLP技術(shù)對大白豬、北京黑豬及萊蕪豬MC4R基因D298N突變位點(diǎn)進(jìn)行了多態(tài)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：大白豬（引入品種）和北京黑豬（培育品種）含D298N位點(diǎn)等位突變所以瘦肉率高，肌內(nèi)脂肪含量低。MC4R基因D298N突變位點(diǎn)很可能與肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)［35］。以上研究表明MC4R可以作為與豬脂肪沉積性狀及肉質(zhì)性狀相關(guān)的候選基因。

3.4 MC4R基因在犬方面的研究進(jìn)展

巴彩鳳等［36］成功構(gòu)建了犬MC4R原核表達(dá)載體，此重組體能在E.coli BL21內(nèi)表達(dá)犬MC4R融合蛋白，為進(jìn)一步獲取犬MC4R的單克隆抗體奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，也為研究犬MC4R蛋白的結(jié)構(gòu)和生理功能提供了幫助。張軼博等［37］分析了比格犬黑素皮質(zhì)素受體-4基因多態(tài)性與犬體重的關(guān)系，結(jié)果在比格犬MC4R基因中發(fā)現(xiàn)2處單堿基缺失突變，1個單堿基顛換變異，存在Psh AⅠ酶切位點(diǎn)，并基于PshAⅠ酶切位點(diǎn)建立了PCR-RFLP技術(shù)。統(tǒng)計分析顯示犬MC4R基因型與體重顯著相關(guān)，可以考慮將MC4R基因作為犬體重的候選基因。巴彩鳳等［38］克隆了犬MC4R基因片段，并尋找其多態(tài)性位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)錦州本地犬MC4R基因片段有2處A堿基缺失突變。表明本地犬中存在MC4R基因的多態(tài)性。

3.5 MC4R基因在雞方面的研究進(jìn)展

李國輝等［39］利用PCR-SSCP和DNA測序的方法，對京海黃雞雞群MC4R基因多態(tài)性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)存在2個單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)，分別為第662位堿基G→C點(diǎn)突變和第733～734位堿基間插入一個C堿基。陶勇等［40］以140只京海黃雞為試驗材料，以MC4R為候選基因，采用PCR-SSCP和DNA測序技術(shù)分析了MC4R基因在京海黃雞群體中的多態(tài)性。結(jié)果表明：MC4R基因編碼區(qū)第662 bp處有G→C堿基的點(diǎn)突變，在京海黃雞中檢測到AA、AB、BB三種基因型，由此推測，MC4R基因可能對于雞生長性能具有很大的影響或與控制生長性能的主基因連鎖。霍明東等［41］以高低脂雙向選擇肉雞品系為研究材料，采用PCR-SSCP和測序方法檢測MC4R基因編碼區(qū)的SNPs，結(jié)果在編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)1個G315T的突變。推測MC4R基因可能是影響雞早期生長和肌肉性狀的主效基因或與主效基因相連鎖。仇雪梅等［42］利用PCR-SSCP和DNA測序的方法，對資源家系F2代雞群MC4R基因多態(tài)性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)存在4個單核苷酸多態(tài)（single nucleotide polymorphisms，SNPs）位點(diǎn)。表明MC4R基因可以作為影響和控制雞體重、生長等屠體性狀的主要候選基因。

3.6 MC4R基因在牛羊方面的研究進(jìn)展

Haegeman等［21］對牛的MC4R基因的cDNA進(jìn)行了克隆并測序。結(jié)果表明，在DNA水平上，牛的MC4R基因與人、豬、鼠的同源性分別達(dá)到87%、85%和89%，在蛋白質(zhì)水平，同源性都超過90%。通過單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）發(fā)現(xiàn)有2個核苷酸發(fā)生改變：T和G分別被替換成C和A，保守的纈氨酸被替換成丙胺酸（Val 145Ala），丙胺酸被替換成蘇氨酸（Ala 172 Thr）。Thue等［43］通過對加拿大肉牛的遺傳圖譜研究，將牛的MC4R基因最終定位在牛的24號染色體上（BTA24）。張菊研究表明：MC4R的1 232位點(diǎn)的G→A的突變與綿羊背膘厚度間存在關(guān)聯(lián)，AG和AA型較GG型具有較高的背膘厚度［44］。劉宏宇等［45］研究發(fā)現(xiàn)，秦川牛MC4R基因存在6個突變位點(diǎn)，其中129位點(diǎn)（由A突變?yōu)镚）極顯著與活重相關(guān)；1 069位點(diǎn)（由C突變?yōu)镚）與活重、屠體重、背膘厚和大理石紋極顯著相關(guān)，這兩個位點(diǎn)可作為秦川牛的屠體鮮肉品質(zhì)的遺傳標(biāo)記。張春雷等［46］對6個牛品種MC4R的研究，發(fā)現(xiàn)4個多態(tài)位點(diǎn)，其中2個多態(tài)位點(diǎn)（-293C＞G和-129A＞G）與6月齡南陽牛的體重和日增重相關(guān)，但在 24月齡時差異不顯著（P＞0.05）。黃萌等［47］的研究表明，MC3R與MC4R基因與肉牛背膘厚度有顯著相關(guān)（P＜0.05），是影響肉牛育肥性狀的候選基因。

4 展望

MC4R作為促腎上腺皮質(zhì)素的受體，其中樞神經(jīng)調(diào)節(jié)功能主要為抑制攝食，從而減少體脂，降低體重，因此，在人類肥胖研究中深受關(guān)注。隨著MC4R基因研究的深入，對哺乳動物的研究也廣泛展開，但目前對草食家畜涉及的廣度與深度還相對較低。

草食家畜體重、肥育效率、幼畜早期生長速度以及胴體肉質(zhì)等，長期以來一直是人們極為關(guān)注的問題。MC4R開辟了從分子生物學(xué)領(lǐng)域解決這些問題的通道。我們可以通過基因型調(diào)控技術(shù)，提高或降低MC4R及其抑制劑aguoti、AGRP在草食動物中樞神經(jīng)中的分布密度與表達(dá)量來控制其活性，以增強(qiáng)動物食欲，從而可以從分子水平上控制其體重增長，達(dá)到提高肌肉生長速度和改善肉質(zhì)的目的。還可以通過對MC4R基因突變位點(diǎn)的多態(tài)性分析，篩選出有利于草食家畜體重增長、生長增速及肥育、屠宰性狀的相關(guān)候選基因，并以此選擇種用個體，用分子育種的手段，加速培育體重大、發(fā)育快、胴體品質(zhì)好的草食家畜新品種。

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