實時熒光PCR技術(shù)在手足口病原學(xué)檢查中的應(yīng)用

王七生，秦金勇，蔣立立

桂林市疾病預(yù)防控制中心檢驗科，廣西桂林 541001

手足口病是腸道病毒引起的急性傳染病，具有流行性強、傳染性強、傳播途徑復(fù)雜等特點，好發(fā)于兒童（5歲以下），手足口病較常見的病原體是柯薩奇病毒A16型（CoxA16）和腸道病毒71型（EV71）[1-2]。近年來該病呈現(xiàn)出了新的特點：①發(fā)病高峰期明顯提前；②全國高發(fā)地區(qū)區(qū)域擴大，且發(fā)病強度高于往年；③發(fā)病90%以上為5歲以下兒童，托幼兒童和散居兒童大約各占一半；④實驗室確診的病例大多數(shù)是EV71型，危重患兒病例增加。這為及早、迅速和準確地檢測確定手足口病原體傳染性疾病的治療與預(yù)防提出了更高的要求。本文采用實時熒光PCR技術(shù)，對桂林市婦女兒童醫(yī)院確診的手足口病患兒進行腸道病原學(xué)進行鑒別與分析。現(xiàn)將實驗報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

樣本來源于桂林市婦女兒童醫(yī)院，2010年臨床確診為手足口病的患兒，共40例，診斷依據(jù)衛(wèi)生部發(fā)布的《手足口病預(yù)防控制指南》（2008 版）[3]。 年齡 0.75～10.00 歲，平均 3.15 歲。均使用肛拭子法采集患兒糞便標本，共計40份樣本，樣本均按照《手足口病預(yù)防控制指南》的要求進行采集儲存及轉(zhuǎn)運操作。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 樣本采集使用肛拭子法，用無菌棉簽采集患兒的糞便，放于病毒漢格氏液保存管，冷藏運至實驗室，-20℃保存，取上清200 μl用于提取病毒RNA[4]。

1.2.2主要試劑及儀器 本實驗室用熒光PCR儀器為美國ABI公司生產(chǎn)，型號為7500。所用分光光度計為美國Varian生產(chǎn)的Cary50Probe紫外光度計。所用超速離心機為德國Eppendorf生產(chǎn)。試劑盒包括提取RNA的試劑盒等均購于北京金豪生物有限公司。

1.2.3 檢測試劑 腸道病毒通用型核酸檢測試劑盒，適用于EV71、柯薩奇病毒的核酸篩查，柯薩奇病毒A-16核酸檢測試劑盒（CVA-16）適用于柯薩奇病毒A-16病毒核酸的特異性檢測；腸道病毒71型核酸檢測試劑盒（EV71）適用于腸道病毒71型核酸的特異性檢測[4-5]。引物及探針信息：EV-Com引物（上游）：5’-GTG TGT CGT AAC GGG CAA CTC-3’；EV-Com 引物（下游）：5’-TTT CAA TTG TCA CCA TAA GCA GC-3’；EV-Com 熒 光 探 針 ：5’-ACC GAC TAC TTT GGG TGT CCG TGT TTC C-3’；CVA-16 引物（上游）：5’-CCA TTG GTG CTC CCA CTA CA-3’；CVA-16 引物（下游）：5’-GCT TCA GTG TTG GCA GCT GTA G-3’；CVA-16 熒光探針：5’-CTG TGA ACA ACC AAG TAA ACC GCT CC-3’；EV71 引物（上游）：5’-CAG AAC ACA CAG GTG AGC AGT C-3’；EV71 引物（下 游）：5’-GCG TGT CTC AAT CAT ACT CTC ATC-3’；EV71 熒光探針：5’-CCA GCA CTC CAA GCT GCT GAA ATT GG-3’。

1.2.4 實時熒光PCR檢測 肛拭子法提取并處理的40份樣本，按照試劑盒說明書操作，首先使用Trizol法提取標本的RNA，然后在擴增儀上將萃取得到的RNA進行擴增，最后根據(jù)PCR試劑盒提供的優(yōu)化方法進行退火溫度、離子濃度、探針濃度、引物濃度等優(yōu)化處理，并建立標準曲線[6-7]。標準曲線建立方法即：將陽性標準品置于260 nm紫外光下進行吸光度測定，以計算出DNA的拷貝數(shù)。并分別連續(xù)10倍稀釋且進行熒光PCR檢測以獲得標準曲線，且經(jīng)重復(fù)性、敏感性檢測。所有操作完成時間為3～4 h。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

將實驗數(shù)據(jù)建立Excel數(shù)據(jù)庫，采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，計量資料采用非參數(shù)秩和檢驗。P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樣本標準曲線

用10倍倍比稀釋的標準模板作定量標準曲線，CVA-16標準曲線相關(guān)系數(shù)分別為r=0.914，曲線斜率為-3.167；EV71標準曲線相關(guān)系數(shù)分別為r=0.952，曲線斜率為-3.382；EVCom標準曲線相關(guān)系數(shù)分別為r=0.964，曲線斜率為-3.386。線性相關(guān)性良好。PCR擴增效率為94%，說明PCR反應(yīng)對模板的擴增很完全。

2.1 肛拭子標本的實時熒光PCR檢測結(jié)果

40份肛拭子標本通過前述3種核酸檢測試劑盒的實時熒光PCR檢測，檢測結(jié)果：腸道病毒通用型核酸檢測試劑盒（EV-Com）陽性為22例，柯薩奇病毒A-16核酸檢測試劑盒（CVA-16）陽性為9例（占22.5%），腸道病毒71型核酸檢測試劑盒（EV71）陽性為12例（占30%），其中CVA-16或EV71陽性，都同時為EV-Com陽性。EV-Com陽性病例的肛拭子標本采集時間為起病后1～7 d，發(fā)病3 d的肛拭子樣本EV-Com陽性病例占75%。

3 結(jié)論

實時熒光PCR是一種核酸定量技術(shù)，具有普通PCR的高靈敏性[8]，已經(jīng)成為腸道病毒診斷的重要手段。本研究中采用實時熒光PCR方法，嚴格按照檢測試劑盒說明書操作，對利用肛拭子法采集的共40份標本進行了病毒Cox A16和EV71的核酸檢測。結(jié)果CVA-16標準曲線相關(guān)系數(shù)分別為r=0.914；EV71標準曲線相關(guān)系數(shù)分別為r=0.952，柯薩奇病毒A-16核酸檢測試劑盒（CVA-16）陽性為9例，腸道病毒71型核酸檢測試劑盒（EV71）陽性為12例，結(jié)果與有關(guān)文獻相似[9]。研究發(fā)現(xiàn)手足口病病毒檢出率與標本的采集時間相關(guān)性，發(fā)病前3 d的肛拭子樣本進行檢查更利于病原學(xué)檢出。而CVA-16和EV71腸道病毒還是手足口病的主要病原體，實時熒光PCR技術(shù)對手足口病的病原診斷具有重要價值，它操作簡便，穩(wěn)定性良好，重現(xiàn)性好[10]，可以在3～4 h內(nèi)獲得檢測結(jié)果，可以作為手足口病腸道病毒的快速檢測方法，為臨床及時采取救治方案提供一種早期診斷依據(jù)[11]。

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