吳江鋒,李紅軍
(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖北 宜昌 443003 E-mail:313229177@qq.com)
冰凍切片具有制片迅速、簡便、切片較薄、組織變化不大、無需脫水及浸臘等特點(diǎn)[1],能很好地保存類脂、脂肪等成分,尤其在免疫組織化學(xué)染色中,更能完好地保存大部分的抗原活性及各種酶類。尤其對有機(jī)溶劑或熱溫度耐受差的細(xì)胞表面抗原和水解酶的保存就更好。常用于臨床診斷和科學(xué)研究。要制作高質(zhì)量的冰凍切片并非易事,受到多種因素的影響。筆者通過多年的實(shí)踐總結(jié)了一些體會(huì),供同仁們參考。
1.1 儀器及試劑 德國Leica-CM1900型恒溫冷凍機(jī)、一次性切片刀片、普通膠水、甲醇、蘇木精染液、2%鹽酸、蔗糖、明膠。
1.2 切片前的準(zhǔn)備
1.2.1 冰凍切片機(jī)的準(zhǔn)備 冰凍切片機(jī)在備用狀態(tài)下,設(shè)置夜間除霜,白天根據(jù)不同標(biāo)本預(yù)設(shè)溫度,避免經(jīng)常開關(guān)機(jī)。使用前將刀架與組織塊的角度調(diào)整好,調(diào)節(jié)好防卷板的位置,保持防卷板干凈、平整,凍頭清洗干凈[2]。
1.2.2 載玻片預(yù)處理 將載玻片用1%HCl浸泡0.5h,撈出用清水沖洗干凈再用95%的酒精浸泡10min,蒸餾水洗凈,烤干后備用。
1.2.3 托物臺(tái)預(yù)處理 將數(shù)個(gè)托物臺(tái)放入-20℃冰箱中預(yù)處理10min左右。
1.3 取材 動(dòng)物和人死后2h內(nèi)材料均可供取。材料越新鮮越好,取材要快速準(zhǔn)確平整。厚度一般<2cm×2cm×2cm。
1.4 包埋 細(xì)小的組織需用普通膠水包埋,對破脆較小的組織標(biāo)本,預(yù)先用少許膠水涂于切片托上做一冰臺(tái),墊高后再放小塊組織進(jìn)一步冰凍。特殊的標(biāo)本用蔗糖和明膠,其余均可直接放置速凍臺(tái)。
1.5 切片 切片前要仔細(xì)觀察組織塊的變化,組織在冷凍過程中,從周邊開始變白,最后中間留下綠豆大小的反光區(qū),很快消失,這時(shí)及時(shí)固定組織托并開始修塊,因?yàn)樽罴训那衅瑴囟葹?20℃到-23℃,大約10s左右??焖偾衅?。
1.6 貼片 貼片時(shí)載玻片與刀面的角度要成40°左右,根據(jù)組織塊而定,如果防卷板礙事可直接貼。依靠載玻片的熱量將組織切片吸起,自然攤平。
1.7 固定染色 切好的片子立即放入甲醇固定液中1~2min。固定液要及時(shí)更換。切片從固定液中取出后迅速水洗,蘇木精染液中浸染2~3min,然后取出水洗并藍(lán)化。2%鹽酸乙醇分化數(shù)秒,0.1%氨水之藍(lán),顯微鏡下觀察染色情況,以核染色清晰為度。伊紅缸內(nèi)燃胞漿數(shù)秒,水洗,梯度乙醇脫水,兩個(gè)二甲苯透明,中性樹膠封片。
通過上速方法切出的片子,組織結(jié)構(gòu)形態(tài)完整,細(xì)胞染色清晰,無折疊。
有一臺(tái)性能良好的冰凍切片機(jī)是冰凍切片質(zhì)量的基礎(chǔ),切片前,冰凍切片機(jī)的準(zhǔn)備、載玻片和托物臺(tái)的預(yù)處理是切好冰凍切片的必不可少的重要環(huán)節(jié)。
新鮮、干凈、無雜質(zhì)的材料是冰凍切片的必要保障。材料大小要合適,最理想的取材大小為1.5cm×1.5cm×1.5cm,該規(guī)格的材料不需要包埋。若材料太小可用膠水包埋,膠水包埋冷凍迅速,質(zhì)感均勻,易切出完整的組織切片,易展片,留片后膠水易清洗、組織易分離、價(jià)廉、操作方便[3]。對于易脆的組織或者需要連續(xù)切片的組織,可用7.5%明膠-15%蔗糖對組織進(jìn)行包埋,待明膠蔗糖呈凝膠狀時(shí),根據(jù)需要修塊,錫紙包裹后放置到-80℃冰箱進(jìn)一步冷凍(至少2h),切片前將組織塊移至冰凍切片機(jī)內(nèi)復(fù)溫至少半小時(shí)后開始切片,使用7.5%的明膠-15%的蔗糖包埋組織后可以像石蠟切片一樣進(jìn)行連續(xù)切片。蔗糖能使組織維持良好的形態(tài)、防止某些細(xì)胞成分的擴(kuò)散,并充分保持酶的活性。高濃度的蔗糖具有脫水和防止冰晶形成的作用。明膠溶于水后,能相互吸引、交織。明膠與蔗糖混合后可以使蔗糖和水完全充塞在凝膠空隙內(nèi),使組織保持穩(wěn)定的狀態(tài),起到吸水和支撐骨架的作用。
冷凍時(shí)間和溫度的把握是切好冰凍切片的關(guān)鍵[4]。為了減少冰晶出現(xiàn),有效防止冰晶擠壓周圍組織,改變形態(tài)結(jié)構(gòu),需要將組織塊快速地移至冷凍頭。恒冷箱切片機(jī)的室內(nèi)溫度以-15℃到-22℃為宜,而冷凍頭的溫度要根據(jù)組織的性質(zhì)、軟硬度而定。如淋巴結(jié)、肝、脾、腎組織,溫度設(shè)定在-18℃到-20℃為宜;甲狀腺、肺組織為-20℃到-22℃;對于質(zhì)韌、硬的組織如子宮、致密結(jié)締組織的設(shè)置溫度要達(dá)到-23℃到-26℃,切片速度也要相對慢一些,過快會(huì)出現(xiàn)跳刀現(xiàn)象;脂肪組織要降至-30℃。切片的時(shí)間要把握得當(dāng),時(shí)間過短冷凍不好,時(shí)間過長則會(huì)使組織變硬,不僅損傷刀而且組織片也會(huì)出現(xiàn)裂痕。經(jīng)驗(yàn)表明,用戴乳膠手套的拇指輕輕按壓回溫[5],如組織塊變脆應(yīng)立即升溫,也可用手指在組織表面摸一下再切。
切片時(shí)其他細(xì)節(jié)的把握也是提高切片質(zhì)量的重要補(bǔ)充。切片時(shí)切片刀的角度要調(diào)整合適,防卷板調(diào)整到切片刀5°左右的角度,防卷板的前緣與刀面要有足夠的距離,略高于刀刃的最高點(diǎn),固定好后不要輕易移位,使切出的切片順利通過刀與防卷板間的縫隙。修塊時(shí)切忌進(jìn)刀太慢,避免組織斷裂。刀速要均勻,其快慢要根據(jù)不同的組織而定。貼片要細(xì)心而快速,手部切勿上下移動(dòng)更不能顫抖,而且在貼附組織時(shí)手要有一個(gè)向下的伸展動(dòng)作,片子若有卷曲,可用質(zhì)量好的毛筆輕輕壓切片前緣把切片展平,及時(shí)附貼于干凈的載玻片上后,立即置于固定液中。固定后的組織可直接染色或完全自然干后儲(chǔ)存于-80℃冰箱。此外,切片時(shí),為了防止升溫,切片機(jī)的蓋子打開得越小越好。固定液的選用,我們傾向于甲醇,甲醇具有乙醇的固定作用,收縮性比乙醇小得多,且具有快速固定、染色清晰等優(yōu)點(diǎn)。
總之,筆者的體會(huì)是,要制作好一張優(yōu)質(zhì)的冰凍切片,需要控制好各個(gè)操作環(huán)節(jié),而操作人員一絲不茍的工作態(tài)度和責(zé)任感是獲得完美結(jié)果的關(guān)鍵。
[1]陳潔,張雯靜,李堅(jiān).冰凍切片制作中時(shí)間和溫度的研究[J].現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué),2010,22(5):587.
[2]曾訓(xùn),徐洪.控制冰凍切片質(zhì)量的探討[J].中國誤診學(xué)雜志,2009,9(22):5393-5394.
[3]王曉鴻,茍新敏,林宇靜.制作冰凍切片對包埋劑的選擇及應(yīng)用[J].中國實(shí)用醫(yī)藥,2009,4(36):217-218.
[4]劉曉蘭,劉燕,宋月晗,等.冰凍切片制作體會(huì)及常見問題[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2010,10(14):2738.
[5]李建紅,石天峰.冰凍切片制作方法改進(jìn)探討[J].長治醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2007,21(4):306.