低模板量DNA的分型方法及其相關問題

梁小鋒(綜述),周龍虎,雷續(xù)虎(審校)

(1.西北政法大學公安學院,西安 710063;2.常熟市公安局,江蘇常熟 215500;3.解放軍第 323醫(yī)院,西安 710068)中圖分類號:Q819 文獻標識碼:A 文章編號:1006-2084(2011)02-0167-03

基于聚合酶鏈反應 (polymerase chain reaction, PCR)的熒光標記短串聯(lián)重復序列 (short tandem repeat,STR)復合擴增分型是目前法庭科學生物物證DNA分析的常規(guī)主流技術。為了保證實驗結果的準確性、可重復性、實驗室間結果的可比性等 DNA證據(jù)的要求,一般都使用商品化的試劑盒進行 PCRSTR分型。目前,根據(jù)試劑盒生產(chǎn)廠家的推薦,進行STR分型時理想的模板DNA量要求在 0.2～3 ng(簡稱常量模板 DNA),通常獲得最佳分型效果的模板DNA量為 1 ng左右[1]。模板DNA量過高與過低都會出現(xiàn)問題,如位點間的不平衡擴增、+/-A等位基因丟失或插入等[2]。然而,法醫(yī) DNA分析技術在相關案件中的重要作用又使得越來越多微量、超微量、腐敗降解的生物物證檢材,即低模板量DNA(low template DNA,LT-DNA),被提取并要求進行DNA的 STR分型?，F(xiàn)對 LT-DNA STR分型方法予以綜述,并就存在的相關問題加以討論。

1 LT-DNA

法庭科學界目前關于LT-DNA并無明確界定,也有稱之為低拷貝模板 (low copy template,LCN)。實際上,稱之為LT-DNA更為合適。因為LT-DNA STR分型不是基于 PCR擴增時的循環(huán)數(shù) (LT-DNA可通過但不限于增加 PCR循環(huán)數(shù)來提高 DNA量)。Gill等[3,4]將 DNA模板量 <100 pg的定義為 LT-DNA, Caddy等[5,6]認為 <200 pg的就可以稱為 LT-DNA。由于 DNA定量方法之間會存在差異,Budowle等[7]則認為:常規(guī) PCR擴增產(chǎn)物 STR分型時無法獲得結果或 RFUs(相對熒光素單位)低于正常分析隨機閾值的模板DNA稱為LT-DNA更為科學。通常,隨機閾值設定為 150～250 RFUs。實際上,隨機閾值的設定值在實驗室間是存在差異的。另外,混合檢材中經(jīng)常會出現(xiàn)某種低混合比例的成分為LT-DNA(DNA總量可能為常量)?？梢?LT-DNA也存在于常規(guī)循環(huán)數(shù)(28個循環(huán))的 PCR產(chǎn)物中。因此,將LT-DNA定義為“常規(guī)標準 STR分型檢驗時,對檢測信號低于正常分析隨機閾值的任何檢驗結果進行分析及解釋時所對應的模板DNA”更為合適。

2 LT-DNA STR分型方法

LT-DNA STR分型早在 1996年 Taberlet等[8]就有報道,隨后相繼有更多學者研究報道,1999年英國法庭科學服務部將LT-DNA STR分型結果應用于案件中。目前,LT-DNA STR分型方法幾乎都是基于常規(guī)商品化試劑盒進行分析的。

2.1 由 LT-DNA STR分型轉(zhuǎn)化為常量 DNA STR分型

2.1.1 改進DNA提取方法 法醫(yī)常規(guī)生物檢材通過 Chelex-100法就可獲得常量模板 DNA進行 STR分型,對于 LT-DNA生物檢材,可以采用 Microcon100、Clean up、Q IA-micro、Q IA-EZA、硅珠法等多種純化與濃縮方法改進DNA提取,獲得盡可能多及盡可能純的模板DNA。

2.1.2 增加 PCR循環(huán)數(shù),提高 PCR擴增產(chǎn)物 多數(shù)實驗室通過增加 PCR循環(huán)數(shù)來提高擴增敏感度,并被證明 100%有效。研究結果[3]表明,使用 34個循環(huán)數(shù)分型效果最佳。大于 34個循環(huán)并未顯示出優(yōu)勢。而且隨著循環(huán)數(shù)增加,Taq酶的效率會逐漸降低,同時基于實驗環(huán)境和操作的污染不可避免地也增加。目前這個方法已成為英國、澳大利亞等許多國家分析LT-DNA樣本最主要的手段。也有學者提出34個循環(huán)對LT-DNA并非最佳,因為增加的隨機效應明顯提高了偽等位基因的發(fā)生率。Anjos等[9]提出在 32或 28個循環(huán)后加入 Taq酶,之后再進行 4次或 6次擴增效果會更好,可明顯減少各種隨機效應。陳連康等[10]也認為,在 28次后加入 Taq酶再循環(huán) 6次比單一 34次循環(huán)的結果更好。Balogh等[11]應用增加循環(huán)次數(shù)的方法從紙上潛在指紋中獲得了供者的 STR圖譜,同時也指出 38個循環(huán)最有效。

2.1.3 提高毛細管電泳檢測敏感度 許多學者還提出減小 PCR反應體積、過濾 PCR產(chǎn)物以得到更加濃縮的擴增產(chǎn)物[12,13],同時,使用傳導率低的高純甲酰胺、延長進樣時間、增加電壓等方法[14,15]在電泳分離時加入更多的擴增產(chǎn)物,提高檢測敏感度。

2.2 激光捕獲顯微切割和 PCR前的全基因組擴增

對含有LT-DNA的混合檢材通過上述辦法無法進行 STR分型檢測。如果能把LT-DNA從混合檢材中分離出來,然后應用上述辦法或全基因組擴增就可以完成復合 STR分型檢測。近年發(fā)展起來的激光捕獲顯微切割 (laser capture microdissection,LCM)技術可以在顯微鏡直視下快速、準確地獲取所需單個細胞或單一細胞群。LCM技術是 1996年美國國立衛(wèi)生院(N IH)國家腫瘤研究所的 Emmert-Buck等所開發(fā),次年,美國 Arcturus Engineering公司成功實現(xiàn)激光捕獲顯微切割系統(tǒng)商品化銷售。利用LCM可以實現(xiàn)混合斑的有效分離,獲得高純度的LT-DNA,同時避免了干擾物質(zhì)對PCR反應的影響。同時利用LCM也可以捕獲富集一般檢材中的 LT-DNA,保證后續(xù)STR分型的質(zhì)量。Martino等[16]應用該技術方法從單根頭發(fā)毛囊細胞中提取到DNA并成功獲得了 STR圖譜,從 30個單倍體精子細胞中獲得了完整的 STR圖譜,從 5～10個精子細胞中獲得了絕大部分圖譜。該方法隨后被成功用于西西里一起少女遭受性攻擊的案件調(diào)查。國內(nèi)周懷谷等[17]通過 LCM捕獲了 25個陰道上皮細胞和 100個精子細胞,并成功進行 STR分型。顧麗華等[18]從分離出的 7～8個口腔上皮細胞中獲得了 STR分型。

當模板DNA量極少時,PCR擴增就會發(fā)生隨機效應,導致雜合子樣品會造成明顯不對稱擴增,甚至造成等位基因丟失,從而使 STR分型錯誤[13]。因此,利用LCM獲得的單個細胞用常規(guī)試劑盒無法分型成功。所以有學者提出利用全基因組擴增 (whole genome amplification,WGA)技術先對 LT-DNA進行復制,產(chǎn)生大量高品質(zhì)DNA,然后對這些全基因組擴增產(chǎn)物再進行 STR位點的 PCR復合擴增、熒光檢測,就可以得到了明確的DNA分型結果。WGA是一系列針對樣本DNA全部基因組序列進行非選擇性擴增的技術,目的是在無序列傾向性的前提下大幅增加DNA總量,以利于隨后的擴增。常用的WGA方法包括擴增前引物延伸法、簡并寡核苷酸引物法及多重置換擴增等[19]?；诙嘀刂脫Q擴增技術的全基因組擴增方法在DNA復制時具有高度的保真性和準確性,能夠精確地擴增單個細胞的基因組DNA。周懷谷等[20]應用多重置換擴增技術從 10 pg的 DNA模板中得到了 STR圖譜。

理論上講,WGA由于首先對初始模板DNA進行了全面均勻的放大,可以很好地解決 PCR反應時LT-DNA隨機效應的難題。但有學者[21]研究發(fā)現(xiàn), LT-DNA的隨機擴增現(xiàn)象的確阻礙WGA的可靠性。因此,WGA不是解決LT-DNA STR分型的最終方法。

2.3 單分子 PCR擴增分型 從上述研究方法來看, LT-DNA STR分型方法幾乎均采用常規(guī) PCR進行擴增,常規(guī) PCR對模板 DNA量有最低要求。然而, PCR理論指出,模板量最少可以到一個 DNA分子,循環(huán)數(shù)可以是無限的。從這一理論出發(fā),發(fā)展了一項新的 PCR技術-單分子 PCR技術。單分子-PCR指的是以少量或單個 DNA分子為模板進行的 PCR,與常規(guī) PCR相比,具有以下優(yōu)點:極少的模板數(shù),通常為 1、5或 10個 DNA分子;更微型化的體系,大多在5～10μL。作為一項正在發(fā)展的新技術,單分子-PCR也存在一些不足。由于體系使用極少的模板數(shù),引物間極易形成二聚體等副產(chǎn)物,這些副產(chǎn)物的大量堆積將嚴重阻礙正常的擴增反應,因此技術上仍需要進一步完善[22]。如能將單細胞 LCM與單分子-PCR相結合,無疑是解決LT-DNA STR分型的理想手段。

3 LT-DNA STR分型存在的相關問題

3.1 污染的機會增加 PCR-STR分型的高敏感性導致污染是時刻存在的,LT-DNA的污染更是如此,極易受外源 DNA的污染,如談話、打噴嚏等都可以污染,污染機會大大增加。因此,在檢驗過程中必須在無菌的環(huán)境中進行,操作人員必須穿戴一次性手套、衣服及面罩,操作臺及設備必須經(jīng)常清洗和用紫外燈照射,實驗的每一步均要使用陰性對照,以確定是否存在外源 DNA污染,這一點非常重要。同時,盡可能地重復進行 PCR檢驗,檢驗結果必須與所有操作人員的 DNA分型進行比較,必要時,與現(xiàn)場生物檢材提取或案件調(diào)查人員的DNA分型進行比較。

3.2 結果解釋的復雜性 在進行LT-DNA STR分析時,不容忽視的問題是擴增過程中的隨機效應導致的不均衡擴增、等位基因丟失和插入及 Stutter產(chǎn)物顯著增加。而且,得到清晰分型圖譜的概率比較小,很多結果都是混合分型,所以目前很難給分型結果做出可靠的解釋。另外,檢材的數(shù)量極少,一次實驗后就所剩無幾,不太可能按要求進行第二次試驗的重復性檢驗。可是隨機效應的存在使得重復進行PCR分析時,所得到的 LT-DNA STR分型圖譜可能會有差異。這些都增加了結果解釋的復雜性?？梢哉f,LT-DNA STR分型的難點和最大的挑戰(zhàn)就是分型結果的正確解讀。

3.3 案件應用的局限性 LT-DNA的研究結果使人們能夠從只遺留很少量嫌疑人細胞的各種案件現(xiàn)場得到 STR分型結果。由于分型的高敏感性,背景DNA或偶然接觸污染的DNA都有可能被檢測出來,即使檢測到DNA分型,也可能無法解釋或本身就與案件無關。因此,LT-DNA STR分型一般不能用作排除的目的。另外,LT-DNA STR分型能為許多案件提供有用的調(diào)查線索,但不可能給每個案件提供可靠的科學證據(jù)。即使如此,LT-DNA STR分型也使法醫(yī)DNA分析得到了進一步增強。

4 小 結

法庭科學工作者嘗試開發(fā)更多的LT-DNA分型方法,上述分型策略部分可以聯(lián)合應用以達到最優(yōu)化的分型結果。應該通過更加嚴格的實驗質(zhì)量控制,排除一切外源DNA的污染,進而保證分型結果的可靠性和可重復性。使用LT-DNA分型結果時應持審慎態(tài)度?？梢灶A見,隨著對LT-DNA的研究不斷深入,其在法庭科學中的作用會更大。

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