Erufosine對(duì)胃癌細(xì)胞及骨髓細(xì)胞增殖抑制的影響

賀建宇 張利能

1.上海市第六人民醫(yī)院奉賢分院腫瘤科，上海 201400；2.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，上海 200032

烷基磷脂(alkyphosholipids，APLs)和烷基磷酸膽堿(alklphosphocholine，APCs)作為新一代膜信號(hào)PI3K/Akt傳導(dǎo)抑制劑，已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［1-2］。研究表明，APLs和APCs能抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，具有明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)作用，其機(jī)制尚未完全闡明［3-4］。本研究將觀察APCs類藥物Erufosine (erucylphophohomocholine or erucylphospho-N,N,N-trimethylpropylammonium)對(duì)胃癌細(xì)胞及骨髓細(xì)胞的增殖、凋亡的影響，并探討此種影響與Akt蛋白表達(dá)的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

人胃癌AGS細(xì)胞系購(gòu)于上海細(xì)胞庫(kù)；人骨髓細(xì)胞、M3534 Metho- Cult培養(yǎng)基和H4534 MethoCult培養(yǎng)基購(gòu)自StemCell公司；8周齡BALB/c小鼠購(gòu)自中科院上海動(dòng)物所；Erufosine為美國(guó)波士頓大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)中心姚敏博士惠贈(zèng)，用0.9%NaCl溶液配置成20 mmol/L工作母液。RPMI 1640培養(yǎng)液購(gòu)于美國(guó)GIBCO BRL公司；胎牛血清為杭州四季青生物工程材料研究所產(chǎn)品；MTS{tetrazolium compound［3-(4,5-dimethylthia-zol-2-yl)-5-(3-carbo-xymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetra-zolium, inner salt;］}為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品；兔抗Akt抗體、內(nèi)參β-actin和辣根過(guò)氧化物標(biāo)記抗兔二抗購(gòu)于Santa Cruz公司；硝酸纖維素膜購(gòu)自Invitrogen公司；Matrigel購(gòu)自BD公司；膠原酶和彈性蛋白酶購(gòu)自Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

胃癌AGS細(xì)胞常規(guī)方法復(fù)蘇，接種于含5%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液瓶中，每毫升培養(yǎng)液含青霉素和鏈霉素均為100 U，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，生長(zhǎng)至覆蓋70%培養(yǎng)瓶時(shí)，用0.25%的胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 鼠骨髓細(xì)胞的收集

雄性8周齡BALB/c小鼠用CO2吸入法處死。在無(wú)菌層流潔凈工作臺(tái)上用70%乙醇噴霧消毒小鼠。完整干凈切取小鼠脛腓骨，切除長(zhǎng)骨末端的骨骺端至骨髓腔。取一平頭27 G注射器針頭插入骨髓腔，注入含5%胎牛血清的無(wú)菌RPMI1640培養(yǎng)液2 mL，然后再抽出至骨干顏色變蒼白，收集的細(xì)胞懸液注入50 mL的圓錐瓶中保持在濕冰上備用。

1.2.3 MTS比色法測(cè)定Erufosine對(duì)胃癌AGS細(xì)胞和骨髓細(xì)胞增殖的影響［5］

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AGS細(xì)胞及上述收集的骨髓細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105/mL。用拋硬幣法將細(xì)胞隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)平行孔。取實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞懸液接種于96孔板內(nèi)，每孔加100 μL細(xì)胞懸液，溫育24 h后再分別加入8個(gè)倍比稀釋濃度梯度的Erufosine，調(diào)整每孔終體積至200 μL；以不含Erufosine的200 μL RPMI 1640完全培養(yǎng)液為空白對(duì)照組；96孔培養(yǎng)板置于37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)溫育24 h后，每孔加入MTS (5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)溫育4 h后，于酶標(biāo)儀上以490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度(D)值。取3個(gè)平行孔的平均D值計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=［1-(D實(shí)驗(yàn)組平均值/D對(duì)照組平均值)］×100%；以藥物濃度對(duì)數(shù)為橫軸，抑制率為縱軸，作量-效曲線，得半數(shù)抑制率(IC50)及90%抑制率(IC90)。

1.2.4 骨髓克隆形成實(shí)驗(yàn)(colony forming unitgranulocyte-macro phage，CFU-GM)

人骨髓細(xì)胞和新鮮分離的鼠骨髓細(xì)胞分別培養(yǎng)于H4534 MethoCult培養(yǎng)基和M3534 MethoCult培養(yǎng)基中。用20×的實(shí)驗(yàn)藥物制成150 μL不同濃度的Erufosine與150 μL人及鼠骨髓細(xì)胞加至含3 μL解凍的MethoCult培養(yǎng)基的試管中，立即混勻，調(diào)節(jié)鼠骨髓細(xì)胞至每管4×104、人骨髓細(xì)胞每管8×104，試管穩(wěn)定15 min直至氣泡消失。然后將每1 mL細(xì)胞懸液移至100 cm2培養(yǎng)皿中央，輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿使細(xì)胞懸液平坦覆蓋整個(gè)培養(yǎng)皿底面，然后置37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱，鼠骨髓細(xì)胞培養(yǎng)13 d，人骨髓細(xì)胞培養(yǎng)15 d。含30個(gè)或更多細(xì)胞被認(rèn)定為一個(gè)克隆。每組設(shè)4個(gè)平行孔，不同濃度Erufosine組的克隆數(shù)與不加Erufosine的對(duì)照組的比值為該組的克隆抑制率。

胃癌AGS細(xì)胞培養(yǎng)于含5%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中。AGS細(xì)胞加不同濃度的Erufosine藥至3 mL，在MethoCult培養(yǎng)液中培養(yǎng)。AGS細(xì)胞與MethoCult培養(yǎng)液充分混勻后，以1.1 mL加至35 mm培養(yǎng)皿(每個(gè)培養(yǎng)皿含1 000個(gè)AGS細(xì)胞)，然后置37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，最后用甲醇固定，結(jié)晶紫染色并計(jì)數(shù)，每組設(shè)4個(gè)平行孔，取其均數(shù)作為該濃度的值。

AGS腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)后，取5×106個(gè)細(xì)胞溶于200 mL RPMI 1640∶Matrigel為1∶1混合液中，皮下種植于雌性BALB/c裸鼠。腫瘤生長(zhǎng)至7～10 mm時(shí)，于鼠尾靜脈注射Erufosine，給藥量為120 mg/kg，以10 μL的0.9%NaCl溶液溶解上述藥量。24 h后處死裸鼠并收集骨髓細(xì)胞行上述CFU-GM實(shí)驗(yàn)，用手術(shù)刀切取種植腫瘤并切碎，用含4 mg/mL膠原酶0.4 mg/mL彈性蛋白酶和1%FBS的RPMI 1640在37 ℃消化，制成單細(xì)胞懸液。

收集的上述幾種細(xì)胞用含1% FBS的RPMI 1640洗2遍，處理好的AGS加入上述的CFU-GM實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 Western blot檢測(cè)

AGS細(xì)胞培養(yǎng)在5%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中，加Erufosine作用12及24 h后，細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后再經(jīng)裂解緩沖液裂解。取50 μg蛋白加樣至SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離濕轉(zhuǎn)膜法采用5%脫脂牛奶封閉2 h后，使用TBS洗膜，再用兔源抗Akt和內(nèi)參β-actin抗體作用，4 ℃過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的抗兔二抗作用1 h，洗脫后顯影。根據(jù)預(yù)期相對(duì)分子質(zhì)量大小區(qū)域出現(xiàn)的特異性條帶判斷蛋白表達(dá)量的高低，然后圖形系統(tǒng)掃描。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Erufosine對(duì)胃癌AGS細(xì)胞和骨髓細(xì)胞增殖的影響

胃癌AGS細(xì)胞和人及鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)Erufosine作用后，細(xì)胞增殖受抑制，并且這種抑制效應(yīng)隨濃度的上升而增大。AGS細(xì)胞的IC50和IC90分別為(5.8±2.6)μmol/L和(13.5±4.6)μmol/L，人骨髓細(xì)胞的IC50和IC90分別為(96.5±32.6)μmol/L和(232.8±42.8)μmol/L，與AGS細(xì)胞的IC50及IC90相比差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；鼠骨髓細(xì)胞的IC50和IC90分別為(65.5±28.6)μmol/L和(228.8±54.8)μmol/L，與人骨髓細(xì)胞的IC50及IC90相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖1)。

2.2 Erufosine對(duì)胃癌AGS細(xì)胞和骨髓細(xì)胞CFU-GM的影響

CFU-GM抑制效應(yīng)隨Erufosine濃度的上升而增大。荷瘤鼠種植胃癌AGS細(xì)胞的CFU-GM IC50和IC90分別為(4.8±1.6)μmol/L和(7.5±2.4)μmol/L；AGS細(xì)胞的CFU-GM IC50和IC90分別為(7.8±2.5)μmol/L和(13.6±3.6)μmol/L；兩組間IC50及IC90的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。人骨髓細(xì)胞的IC50和IC90分別為(86.5±18.6)μmol/L和(250.8±48.8)μmol/L，與AGS細(xì)胞的IC50及IC90相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；鼠骨髓細(xì)胞的IC50和IC90分別為(76.5±20.6)μmol/L和(242.8±44.8)μmol/L，荷瘤鼠骨髓細(xì)胞的IC50和IC90分別為(68.8±18.6)μmol/L和(242.8±44.8)μmol/L。人與鼠骨髓細(xì)胞IC50和IC90、鼠與荷瘤鼠骨髓細(xì)胞的IC50和IC90差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖2)。

圖1 人胃癌AGS細(xì)胞及人和鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)Erufosine作用后增殖受抑制Fig.1 Proliferation of human gastric cancer AGS cell,human and mouse bone marrow cells were inhibited after treated with Erufosine

圖2 不同濃度Erufosine對(duì)各種細(xì)胞CFU-GM的影響Fig.2 The CFU-GM of several cells were changed treated with different concentration of Erufosine.

2.3 Erufosine對(duì)胃癌AGS細(xì)胞Akt蛋白表達(dá)的影響

AGS細(xì)胞經(jīng)Erufosine 8 μmol/L作用12及24 h，其Akt蛋白表達(dá)明顯下降，且與作用時(shí)間明顯相關(guān)(圖3)。

圖3 Erufosine對(duì)胃癌細(xì)胞Akt蛋白表達(dá)的影響Fig.3 The expression of Akt protein of gastric cancer cell was changed after treated with Erufosine

3 討 論

磷脂類化合物定位于細(xì)胞膜，能干預(yù)細(xì)胞膜的信號(hào)傳遞、抑制細(xì)胞增生和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6-9］。由于磷脂類化合物在體內(nèi)的快速代謝限制了其臨床應(yīng)用，故通過(guò)切除一個(gè)甘油基團(tuán)而合成了新一代APCs。雖然多種烷基溶血卵磷脂化合物均具有明顯的抗腫瘤作用，但因胃腸道或溶血的不良反應(yīng)而無(wú)法應(yīng)用臨床［10-11］。再次改變結(jié)構(gòu)的APCs藥Erufosine明顯降低了溶血的不良反應(yīng)［12-14］。有研究結(jié)果證實(shí)，Erufosine能選擇性抑制多發(fā)性骨髓瘤、乳腺癌和胰腺癌細(xì)胞，其癌細(xì)胞與骨髓細(xì)胞的IC50和IC90分別相差近20倍及50倍，癌細(xì)胞對(duì)Erufosine更敏感，其IC90值為9.5～44.0 μmol/L，而人和鼠骨髓細(xì)胞的IC90約200～220 μmol/L，這巨大的差異使Erufosine作為抗癌藥應(yīng)用時(shí)具有更低的不良反應(yīng)并能全身應(yīng)用［15-16］。Erufosine的Ⅰ期臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示對(duì)大多數(shù)腫瘤均有效［4，6，17-18］。

本研究在Erufosine對(duì)細(xì)胞的增殖抑制實(shí)驗(yàn)(MTS)中發(fā)現(xiàn)，胃癌AGS細(xì)胞在Erufosine作用下其增殖抑制率隨濃度上升而加大，從2 μmol/L時(shí)AGS增殖抑制率約為10%至16 μmol/L時(shí)AGS增殖抑制率竟近達(dá)對(duì)照組的90%。而人和鼠骨髓細(xì)胞在16 μmol/L Erufosine濃度下，其增殖抑制率約為30%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在CFU-GM實(shí)驗(yàn)中，荷瘤鼠AGS與培養(yǎng)AGS瘤細(xì)胞的CFU-GM實(shí)驗(yàn)，其IC50及IC90均約降低2倍(P＜0.01)，說(shuō)明荷瘤鼠已預(yù)先給藥處理也影響后續(xù)在Methocult培養(yǎng)基上的CFU-GM結(jié)果。而荷瘤鼠骨髓與正常鼠骨髓細(xì)胞的CFU-GM數(shù)相差約4%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。120 mg/kg鼠質(zhì)量的Erufosine劑量對(duì)后續(xù)鼠骨髓細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)幾乎沒(méi)有影響，說(shuō)明Erufosine能選擇性作用于癌細(xì)胞并能選擇性保護(hù)骨髓細(xì)胞，與國(guó)外結(jié)果相似，但機(jī)制尚未明確，值得進(jìn)一步研究。同時(shí)是否會(huì)出現(xiàn)延時(shí)不良反應(yīng)及其他器官功能影響，也需繼續(xù)觀察。初步證明一定劑量的Erufosine動(dòng)物全身給藥是安全的，不破壞宿主的骨髓功能并能有效抑制癌細(xì)胞的增殖，與文獻(xiàn)報(bào)道相符［3-4］。

Erufosine的作用機(jī)制尚未完全闡明，有報(bào)道Erufosine能裂解和代謝細(xì)胞膜磷脂，導(dǎo)致PI3K/Akt膜信號(hào)傳導(dǎo)通路阻斷及細(xì)胞的凋亡改變［3-4，8，12，17，19-20］，并能抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路。Runder等［18］報(bào)道Erufosine通過(guò)降低473-Akt絲氨酸磷酸化水平誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。在PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路中，PI3K介導(dǎo)PIP3形成對(duì)生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的Akt激活起了重要的作用，不斷增加的PIP3可引起磷脂酰次黃嘌呤核苷酸相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸激酶PDK1激活和Akt分子活化。在細(xì)胞質(zhì)膜激活的PDK1催化Akt對(duì)蘇氨酸308位氨基酸磷酸化，而充分激活A(yù)kt需要Akt分子上473位氨基酸的磷酸化支持。Erufosine能降低慢性髓性白血病(CML)的融合蛋白P210(BCLABL)的表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo)Rb蛋白表達(dá)、增加P27蛋白的表達(dá)并抑制蛋白激酶C［3-4］。本研究初步探討了Erufosine對(duì)胃癌AGS細(xì)胞的Akt蛋白表達(dá)的影響，在20 μmol/L作用12、24 h時(shí)，對(duì)癌細(xì)胞的Akt磷酸化有明顯抑制，24 h比12 h明顯，但是否隨時(shí)間的延長(zhǎng)繼續(xù)抑制或到一定時(shí)間達(dá)到完全抑制，和抑制的量化程度尚需進(jìn)一步研究。

［1］ WEN W M, ALEX A A. Novel agents on the horizon for cancer therapy ［J］. CA Cancer J Clin, 2009, 59： 111-137.

［2］ VICTOR V L, WILFRIED K. Synergistic inhibition of mitochondrial respiration by anticancer agent erucylphosphohomocholine and cyclosporin A ［J］. J Biol Chem, 2007,282： 37303-37307.

［3］ MARTELLI A M, PAPA V, TAZZARI P L, et al.Erucylphosphohom-ocholine, the first intravenously applicable alkylphosphocholine, is cytotoxic to acute myelogenous leukemia cells through JNK- and PP2A-dependent mechanisms ［J］. Leukemia, 2010, 24(4)： 687-698.

［4］ K?NIGS S K, PALLASCH C P, LINDNER L H, et al.Erufosine, a novel alkylphosphocholine, induces apoptosis in CLL through a caspase- dependent pathway ［J］ . Leuk Res, 2010, 34(8)： 1064-1069.

［5］ FAN S, WU F, MAARTINIUK F,et al. Protective effects of anti-ricin A-chain RNA aptamer against ricin toxicity［J］.World J Gastroenterol, 2008, 14(41)： 6360-6365.

［6］ ZAREMBERG V, GAJATE C, CACHARRO L M, et al.Cytotoxicity of an anti-cancer lysophospholipid through selective modification of lipid raft composition ［J］. J Biol Chem, 2005, 280(45)： 38047-38058.

［7］ OBERLE C, MASSING U, KRUG H F. On the mechanism of alkylphosph-ocholine (APC) induced apoptosis in tumour cells ［J］. Biol Chem, 2005, 386(3)： 237-245.

［8］ BERGER M R, TSONEVA I, KONSTANTINOV S M, et al. Induction of apop-tosis by erucylphospho-N,N,N-trimethylammonium is associated with changes in signal molecule expression and location ［J］. Ann N Y Acad Sci,2003, 1010： 307-310.

［9］ ARGIRIS A, COHEN E, KARRISON T, et al. A phase Ⅱtrial of perifosine, an oral alkylphospholipid, in recurrent or metastatic head and neck cancer ［J］. Cancer Biol Ther,2006, 5(7)： 766-770.

［10］ CRUL M, ROSING H, DE KLERK G J, et al. Phase Ⅰ and pharmacological study of daily oral administration of perifosine(D-21266) in patients with advanced solid tumors ［J］. Eur J Cancer, 2002, 38(12)： 1615-1621.

［11］ ERNST D S, EISENHAUER E, WAINMAN N, et al. PhaseⅡ study of perifosine in previously untreated patients with metastatic melanoma ［J］. Invest New Drugs, 2005, 23(205)：1-7.

［12］ GHOBRIAL I M, ROCCARO A, HONG F, et al. Clinical and translation studies of a phase Ⅱ trial of the novel oral Akt inhibitor perifosine in relapsed or relapsed/refractory Waldenstrom’s macroglobulinemia ［J］. Clin Cancer Res,2010, 16 (3)： 1033-1041.

［13］ FIEGL M, LINDNER L H, JERGENS M, et al. Erufosine, a novel alkylphosphocholine, in acute myeloid leukemia： single activity and combination with other antileukemic drugs ［J］.Cancer Chemother Pharmacol, 2008, (62)： 321-329.

［14］ YOSIFOV D Y, TODROV P T, ZAHARIEVA M M, et al.Erucylphospho-N,N,N-trimethylpropylammonium(Erufosi ne) is a potential anti-myeloma drug devoid of myelotoxicity［J］. Cancer Chemother Pharmacol, 2011, 67(1)： 13-25.

［15］ REBECCA B, CECILE R, LESLIE K, et al. Evaluation of Erufosine, an alkylphosphocholine, on malignant cells and bone marrow CFU-GM［C］. AACR Meeting Abstracts,2008： 5703.

［16］ ADWAN H, B?UERLE T, NAJAJREH Y, et al. Decreased levels of osteopontin and bone sialoprotein Ⅱ are correlated with reduced proliferation, colony formation, and migration of GFP-MDA-MB- 231 cells ［J］. Int J Oncol, 2004, 24(5)：1235-1244.

［17］ MOHAMED R, ERIN R, YUN D, et al. Coadministration of histone deacetylase inhibitors and perifosine synergistically induces apoptosis in human leukemia cells through Akt and ERK1/2 inactivation and the generation of ceramide and reactive oxygen species ［J］. Cancer Res, 2005, 65： 2422-2432.

［18］ RUDNER J, RUINER C E, HANDRICK R, et al. The Aktinhibitor Erufosine induces apoptotic cell death in prostate cancer cells and increases the short term effects of ionizing radiation［J］. Radiat Oncol, 2010, 5： 108.

［19］ GILLIS J J, DENNIS P A. Perifosine： update on a novel Akt inhibitor ［J］. Curr Oncol Reports, 2009, 11(2)： 102-110.

［20］ HIDESHIMA T, CATLEY L, YASUI H, et al. Perifosine,an oral bioactive novel alkylphospholipid, inhibits Akt and induces in vitro and in vivo cytotoxicity in human multiple myeloma cells ［J］. Blood, 2006, 107(10)： 4053-4062.