聚蛋白多糖酶與膝骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)性研究

鄧紫玉 孫鹥 林俊 萬(wàn)穎 屈曉雯 趙芳

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是中老年人最常見(jiàn)的骨關(guān)節(jié)疾病，其最早出現(xiàn)的改變是關(guān)節(jié)軟骨的損傷。軟骨破壞的病理表現(xiàn)是軟骨外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的降解，而聚蛋白多糖的丟失是這一過(guò)程的主要病理表現(xiàn)之一［1］。正常、退行性變的關(guān)節(jié)軟骨在代謝轉(zhuǎn)化過(guò)程中釋放的代謝產(chǎn)物進(jìn)入血液和關(guān)節(jié)液中，聚蛋白多糖酶(ADAMTSs)就是這樣一種相對(duì)特異的軟骨代謝標(biāo)志物。本研究通過(guò)檢測(cè)血液和關(guān)節(jié)液中的ADAMTSs，以探討其與OA的相關(guān)關(guān)系及在OA早期診斷中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 為2008年11月至2011年3月云南省第一人民醫(yī)院住院及門診膝骨關(guān)節(jié)炎患者。其中男36例，女51例，23～81歲，平均45.8歲，均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)分會(huì)1987的骨關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。30例健康體檢者為正常對(duì)照組。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)［2］①有炎癥、創(chuàng)傷及手術(shù)史，腫瘤、糖尿病等疾病的患者。②診斷或疑似為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的患者。③檢查前兩周內(nèi)使用過(guò)糖皮質(zhì)激素、非甾體抗炎藥的患者。④妊娠、哺乳期間的婦女。⑤有感染性關(guān)節(jié)炎、其他反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎等關(guān)節(jié)疾病的患者。

1.3 主要試劑 采用德國(guó)的Invitek GmbH公司提供的聚蛋白多糖酶活性測(cè)定試劑盒。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 抽取患者關(guān)節(jié)液和血清，凍存于-70℃。樣品在檢測(cè)前恢復(fù)至室溫，嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。樣本首先用底物孵育。底物被水解15 min，反應(yīng)成2個(gè)多肽片段，伴有N基末端ARGSVIL多肽通過(guò)雙抗體夾心酶聯(lián)反應(yīng)定量測(cè)定。首先在酶標(biāo)板預(yù)包被抗新表位ARGSVIL抗體，加入蛋白水解反應(yīng)混合物孵育，然后加入抗聚蛋白多糖二抗，最后加入辣根過(guò)氧化酶后無(wú)色的顯色劑轉(zhuǎn)變成黃色，在450 nm 處檢測(cè)光密度值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出樣品中聚蛋白多糖聚合酶活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。所得數(shù)據(jù)以表示，用分析OA及對(duì)照組中各指標(biāo)OD值之間的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組別關(guān)節(jié)液ADAMTS-4的濃度 見(jiàn)圖1。早期OA患者關(guān)節(jié)液中的ADAMTS-4濃度為(53.05±16.11)pM，中晚期OA患者關(guān)節(jié)液中的ADAMTS-4濃度為(28.34±10.87)pM，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 ADAMTS-4在關(guān)節(jié)液中的表達(dá)

2.2 不同組別血清中ADAMTS-4的濃度 見(jiàn)圖2。早期OA患者血清中的ADAMTS-4濃度為(31.23±18.34)pM，中晚期OA患者血清中的ADAMTS-4濃度為(20.11±9.22)pM，正常對(duì)照血清中大部分標(biāo)本無(wú)法檢測(cè)出ADAMTS-4濃度，在計(jì)算時(shí)按＜10pM進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明，早期和中晚期OA組均高于正常對(duì)照，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);兩組相比，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖2 ADAMTS-4在血清中的表達(dá)

3 討論

OA是中老年人最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)退行性疾病，困擾著全世界約2億多患者。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，55～64歲的人群中發(fā)病率達(dá)40%，隨著世界老齡化人群的增加，OA的發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)［3］。中國(guó)OA患者人數(shù)估計(jì)將超過(guò)1億，OA導(dǎo)致的痛苦和殘疾嚴(yán)重?fù)p害患者的生活質(zhì)量并成為社會(huì)的一個(gè)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)之一。當(dāng)前對(duì)于OA病程中作用于蛋白聚糖的各種蛋白水解酶的探索方興未艾，其中ADAMTS-4和ADAMTS-5在OA中的發(fā)病機(jī)制研究已成為熱點(diǎn)［4-8］。

引起軟骨降解的原因很多，該過(guò)程中最主要的原因是蛋白水解酶活性增高。聚蛋白多糖酶是一種蛋白水解酶，是指能在核心蛋白球間區(qū)(IGD)Glu373-Ala374位點(diǎn)降解聚蛋白多糖的蛋白酶，被廣泛認(rèn)可的有ADAMTS-4和ADAMTS-5。

關(guān)節(jié)液及血清學(xué)檢查用于OA的早期診斷一直在探索中，近年陸續(xù)報(bào)道了一些與軟骨代謝有關(guān)的生物標(biāo)志物，它們包括一些軟骨成分、細(xì)胞素、蛋白酶等。聚蛋白多糖酶是與OA關(guān)系密切的酶，Naito等［9］通過(guò)對(duì)正常軟骨和OA軟骨的研究認(rèn)為，ADAMTS-4在人OA的聚蛋白多糖的降解中起主要作用，而ADAMTS-5呈結(jié)構(gòu)性表達(dá)。OA關(guān)節(jié)中也有ADAMTS-4和ADAMTS-5的基因表達(dá)。而且ADAMTS-4 mRNA在OA軟骨中的表達(dá)明顯上調(diào)［10］。以上結(jié)論與本研究一致。本研究通過(guò)檢測(cè)關(guān)節(jié)液及血清中聚蛋白多糖酶的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了聚蛋白多糖酶參與了軟骨聚蛋白多糖酶的分解代謝，ADAMTS-4和ADAMTS-5是在OA病理機(jī)制中最可能起作用的酶。因?yàn)锳DAMTS-4在OA早期和中晚期關(guān)節(jié)液和血清中明顯增多，尤其是ADAMTS-4在OA血清中的表達(dá)明顯上調(diào)，說(shuō)明ADAMTS-4有早期診斷意義。當(dāng)然，ADAMTS-4在中晚期OA軟骨降解中同樣有重要作用。對(duì)該酶的抑制不僅有可能防止OA的發(fā)生，而且有可能控制OA的進(jìn)展。

結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與已有的文獻(xiàn)報(bào)道，我們認(rèn)為ADAMTSs在OA病變過(guò)程中起了重要作用。ADAMTSs的特異性有待于進(jìn)一步證實(shí)，臨床應(yīng)用ADAMTSs作為輔助早期診斷OA時(shí)，須緊密結(jié)合臨床特點(diǎn)。ADAMTSs的發(fā)現(xiàn)為預(yù)防和治療OA提供了一定途徑。

［1］Hardingham T.Extracellular matrix and pathogenic mechanisms in osteoarthritis.Curr Rheumatol Rep，2008，10(1):30-36.

［2］徐海濤，陳游，陳立科，等.不同干預(yù)因素對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎患者滑液中MMP-3和TIMP-1的影響.中南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2008，33(1):47-58.

［3］談超，魏偉.骨關(guān)節(jié)炎的病因研究和治療的進(jìn)展.頸腰痛雜志，2002，23(2):166.

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