血小板源性生長因子受體-β在蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣中的作用

王燈亮 康德智 游鴻海 林章雅 林元相

顱內動脈瘤破裂出血是引起蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)最常見的原因，而動脈瘤性SAH的患者中約30% ～90%可發(fā)生腦血管痙攣［1］(cerebral vasospasm，CVS)，是SAH患者死亡和致殘的主要原因。近年來，關于血小板源性生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)在CVS的作用越來越受人們的關注。它是在血小板中發(fā)現的一種生長因子，是一種重要的促分裂劑，其中PDGF-BB是最重要的細胞增殖和遷移的趨化因子，在SAH后CVS的發(fā)生過程中，血管內皮受損脫落，完整性破壞刺激血管壁PDGF高表達［2］，通過與靶細胞上的血小板源性生長因子受體(Platelet derived growth factor receptor，PDGFR)，而 PDGFR-β 是 PDGFBB的特異性受體。本實驗通過建立兔CVS的動物模型，觀察基底動脈的管徑變化、超微結構和PDGFR-β的表達變化規(guī)律，根據配體和受體的結合特點，進一步從側面反映出PDGFBB在SAH后CVS的作用，為臨床上更好的防治CVS提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 動物及其分組 健康清潔的新西蘭大白兔36只(上海生旺實驗動物養(yǎng)殖有限公司提供)許可證號SCXK(滬)2007-0007，質量2.0～2.8 kg，雌雄不限。其中制模導致死亡9只，重新補入實驗動物9只后，隨機分為2組:①對照組:6只。②SAH組:30只。SAH組根據注血后處死時間，隨機分為注血后1、3、5、7、10 d，共5 組，每組 6 只。

1.2 CVS模型的制備 采用枕大池二次注血法建立穩(wěn)定的兔CVS模型。以鹽酸氯氨酮(30 mg/kg)和鹽酸氯丙嗪(7.5 mg/kg)聯(lián)合行肌內注射麻醉，側臥位枕部常規(guī)消毒后，充分暴露寰枕關節(jié)間硬脊膜，用2 ml注射器針頭行枕大池穿刺，緩慢釋放腦脊液0.4 ml/kg，同時將未抗凝的等量兔自體耳中央動脈血，緩慢注入枕大池，術后保持頭低位30 min。對照組用等量的37℃生理鹽水代替動脈血，余處理同上。48 h重復上述操作，注入的動脈血量為0.2 ml/kg。二次注血后24 h為SAH后第1天，依次類推。

1.3 標本留取方法 將SAH組按照不同時間點、對照組于造模后第5天過量麻醉，充分暴露心臟和主動脈根部，夾閉下腔靜脈和降主動脈，左心室穿入自制灌注針頭，同時剪開右心房放血，用多聚甲醛溶液經心臟灌注固定后，開顱取含基底動脈的腦干，置入多聚甲醛固定24 h后，進行組織取材、石蠟包埋、組織切片(與血管橫斷面平行，層厚4 μm)。

1.4 基底動脈直徑測量 每個標本分別切1張切片，行常規(guī)蘇木精-伊紅染色，并通過計算機圖像分析系統(tǒng)(Image-pro plus5.1)，量化分析對照組和SAH各組基底動脈管腔直徑變化。

1.5 透射電子顯微鏡觀察 另取新西蘭大白兔4只，將其隨機分為2組:①對照組(NS組):2只。②SAH組術后第7天:2只。制模及取材過程大致同上，灌注時采用的是預冷的2.5%戊二醛溶液。具體過程:3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定，1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀后固定，酒精-丙酮脫水，環(huán)氧樹脂618包埋劑包埋;超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，飛利浦208型透射電鏡觀察、攝影。

1.6 PDGFR-β表達的檢測及結果判斷 一抗:兔抗兔PDGFR-β多克隆抗體，SANTA CRUZ公司;二抗:PV9002，北京中杉金橋生物工程公司。一抗?jié)舛劝?:200稀釋，并嚴格按照兔超敏二步法試劑盒說明進行免疫組化染色。PBS代替一抗作為陰性對照，乳腺癌組織作為陽性對照。采用 Leica DM2500顯微鏡拍照系統(tǒng)(福建醫(yī)科大學實驗室提供)分別對各組標本基底動脈內皮細胞和平滑肌細胞的PDGFR-β的表達進行觀察，免疫組化染色后細胞質中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，每個標本分別取3張切片進行免疫組化。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行數據處理，各組基底動脈直徑的均數采用單因素方差分析(One-way，AVONA，LSD檢驗)，PDGFR-β的表達情況采用Mann-Whitney U檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 基底動脈內徑的變化 對照組基底動脈管腔呈圓形或橢圓形，在SAH組的各時間點內，基底動脈均發(fā)生了明顯的痙攣，出現管腔直徑的不同程度的縮小(P＜0.01)，在術后第1天下降明顯(P＜0.01)，隨后有所恢復，但與對照組相比，第3、5天仍有下降趨勢，在第7天再次明顯收縮(P＜0.01)，第10天時管徑狹窄程度比第7天有所緩解。SAH各組間比較，除第1天與第5天基底動脈直徑無明顯變化(P＞0.05)，其余組間比較，直徑變化比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表1 各組的基底動脈的管腔直徑(±s，μm)

表1 各組的基底動脈的管腔直徑(±s，μm)

分組(n=6) 對照組 第1天 第3天 第5天 第7天 第10天直徑 871.81±67.50 657.49±27.55 715.32±65.72 618.36±26.61 553.93±51.52 678.45±35.54

2.2 透射電鏡結果 對照組:血管壁超微結構正常，內皮細胞線粒體結構正常，緊密連接呈紡錘形，彈力膜排列整齊，平滑肌細胞、外膜成纖維細胞結構正常。SAH組:血管部分內皮細胞脫落，胞漿空泡樣變，緊密聯(lián)接打開，內皮間隙擴大;內彈力膜扭曲、斷裂;平滑肌細胞變形，排列紊亂，胞漿空泡化;外膜膠原水腫，成纖維細胞增多，可見大量中性粒細胞、單核細胞浸潤。

圖1 -A 對照組:內皮細胞結構正常，緊密連接正常，平滑肌細胞排列規(guī)則(TEM 8000)

圖1 -B SAH組:內皮細胞脫落，緊密連接打開，內彈力膜扭曲、斷裂，平滑肌細胞胞漿空泡化，外膜可見大量中性粒細胞、單核細胞浸潤(TEM 8000)

2.3 PDGFR-β的表達情況 根據文獻［3］，采用量化評分表評價各組的PDGFR-β的表達情況，其免疫組化的陽性反應主要在血管內皮細胞胞漿，平滑肌和外膜細胞胞漿亦可見，呈棕黃色，胞核無著色。在正常對照組，無陽性細胞表達;在SAH組:第1天開始出現少量陽性細胞，表達較淺;第3天逐漸增多，并在第5、7天達到高峰(P＜0.01)，表達較深;到第10天逐漸下降，但仍高于對照組(P＜0.05)。

圖2 A對照組(400);圖B至圖F(400):依次為SAH術后第1、3、5、7、10天。黑色箭頭所指為PDGFR-β的陽性細胞(胞漿呈棕黃色，胞核呈藍色)。

3 討論

SAH后CVS的發(fā)病機制十分復雜，目前認為多種物質共同參與了SAH后CVS的發(fā)生，其中PDGF是其中重要的一種［4］。自Borel等［5］報道在因CVS死亡的患者腦脊液中發(fā)現PDGF-AB升高，在鼠痙攣模型中發(fā)現PDGF和細胞增生有關，而增生可被PDGF拮抗劑抑制的現象后，PDGF在CVS發(fā)生、發(fā)展過程中的作用日益受到人們的關注。臨床和動物實驗均表明PDGF在血管內皮細胞及平滑肌細胞的表達確實存在于痙攣血管中。

PDGF是結締組織細胞如成纖維細胞、平滑肌細胞、血管內皮細胞等的強有絲分裂原和化學驅動劑。目前發(fā)現PDGF家族成員至少有4個，即PDGF-A、B、C和D。PDGF一般以有二硫鍵連接的同源二聚體或異源二聚體組成，如PDGF-AA、BB、CC和DD［6］，尤其PDGF-BB是最重要的細胞增殖和遷移的趨化因子。PDGF生物學特征主要有三方面:一是促細胞分裂作用，能刺激多種細胞分裂增生。二是化學趨化性，PDGF對成纖維細胞和平滑肌細胞有趨化性。三是血管收縮效應。PDGF與靶細胞膜受體結合介導動脈壁平滑肌細胞由中膜遷移到內膜并增生，在刺激動脈壁平滑肌細胞增殖的同時促進了膠原蛋白的合成與分泌。

表2 SAH后基底動脈的PDGFR-β的表達量化表

PDGF受體包括兩種結構相似酪氨酸激酶受體PDGFR-α、β。PDGFR-α主要在胚胎期神經嵴細胞及體節(jié)的發(fā)育過程中其重要作用［7］，而PDGFR-β主要參與血管壁細胞的發(fā)育，具有吸收和促進外膜細胞、平滑肌細胞增殖的作用，在血管形成后期發(fā)揮重要作用［8］。PDGFR-α可與PDGF A、B和C結合，PDGFR-β可與B和D結合，受體與PDGF結合后可發(fā)生二聚化和自身磷酸化反應，從而激活幾種特定的細胞內分子，引起不同信號傳導通路的級聯(lián)反應，產生相應的病理生理反應［9］。

研究表明［10］，在外源PDGF-BB注入蛛網膜下腔后，腦血管痙攣是逐漸的加重的過程，吳軍等［11］在大鼠CVS模型中證實了PDGF mRNA轉錄和PDGF-BB蛋白表達增強與SAH后CVS的血管增生性變化有關。因此在SAH后痙攣血管的PDGF-BB表達升高，與CVS的發(fā)生密切有關，而PDGFR-β與PDGF-B鏈有高親和力［12］，后者許多生理作用的有效發(fā)揮，需要結合PDGFR-β，因此在SAH后CVS的發(fā)生中可能伴隨著PDGFR-β表達的上調。但目前未見有對PDGFR-β在CVS的痙攣血管中表達時間窗的相關研究。

本實驗通過兔枕大池二次注血法建立兔CVS模型，結果提示兔CVS模型的血管痙攣現雙相期改變，急性腦血管收縮出現在第1天，隨后逐漸緩解，而遲發(fā)性CVS在第3天左右出現，在第7天達到高峰后逐漸緩解，與臨床上SAH患者出現CVS的時相基本一致。同時，透射電鏡示SAH組的基底動脈出現相應的超微結構變化，這均表明實驗模型的制作是成功的。本實驗應用免疫組化技術觀察PDGFR-β在SAH后血管壁的表達情況，發(fā)現在正常對照組的血管壁上無陽性細胞表達，在SAH后第1天開始出現少量陽性細胞，第3天逐漸增多，在第5、7天達到高峰后，第10天逐漸下降，表達部位主要在血管內皮細胞上，平滑肌和外膜亦可見有表達，規(guī)律呈現一定的時序性，且其表達時相與管腔狹窄程度的結果基本一致。由此可見，PDGFR-β可能與SAH后CVS的發(fā)生有關，而SAH后PDGFR-β的表達上調可能是與其配體的作用相適應，放大了PDGF對痙攣血管的生理作用，引起CVS的發(fā)生。

在SAH后的初期，大量血凝塊激活血小板等釋放出血管收縮物質，如PDGF、內皮素等，這些縮血管物質作用于腦血管，引起早期的CVS病理改變，此時應用血管擴張劑(罌粟堿、尼莫地平等)可在一定程度上緩解CVS。更為重要的是，PDGF還可以作為游走趨化因子，在基底動脈內長期高表達，并作用于平滑肌細胞，使平滑肌細胞表型的轉化，刺激血管平滑肌細胞增殖分化，引起腦血管重構，管壁增厚，血管順應性下降［13］，從而參與整個腦血管痙攣的病理變化過程。而此時痙攣血管壁的病理變化為器質性的，對血管擴張劑的反應較差。

綜上所述，本實驗通過研究PDGFR-β在CVS痙攣血管的表達規(guī)律，進一步從側面反映出PDGF-BB是SAH后CVS發(fā)生的一種重要的致痙作用，然而，目前關于PDGF-BB在CVS中的具體作用機制尚不明確，有待于今后進一步更好的研究。目前，已有研究認為［14］，SAH后早期使用PDGF抑制劑Trapidil，可有效抑制PDGF及其受體的活性，減輕PDGF對平滑肌的增殖及遷移作用，從而改善痙攣血管的器質性病理改變，這為臨床上更有效的預防CVS的發(fā)生提供了思路。

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