熱休克蛋白70在急性腎損傷中的臨床價(jià)值

曾健 林肇得 羅福漳 鄧朝蓬 黃勝 鄧雪強(qiáng)

熱休克蛋白70(HSP70)是所有原核細(xì)胞和真核細(xì)胞在高溫或應(yīng)激情況下所產(chǎn)生的一組具有高度保守性的蛋白質(zhì)。HSP家族是HSP70中最保守和最主要的一類，它在不同的生物中數(shù)量和功能均有所不同，在大多數(shù)生物中含量最多，而且在細(xì)胞應(yīng)激后生成最為顯著，因此受到廣泛的關(guān)注，也是研究得較為深入的一類HSP。國(guó)內(nèi)外有大量動(dòng)物及臨床實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)HSP70在心肌、肝臟以及腦的缺血再灌注損傷中高表達(dá)并起到保護(hù)作用［1-3］，而對(duì)腎臟研究方面較少。近幾年來(lái)，其在急性腎損傷(AKI)中的作用引起特別的重視，熱休克蛋白70與腎損傷關(guān)系已成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。本研究的目的在于通過(guò)檢測(cè)急性腎損傷患者不同時(shí)期血液和尿液中HSP70水平的動(dòng)態(tài)變化，以及分析其與腎功能、致炎因子的相關(guān)性，探討HSP在急性腎損傷中的腎臟保護(hù)作用和機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象 選擇2008年9月至2011年2月期間，收治于佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院患者，住院內(nèi)期間新發(fā)急性腎損傷男性或女性的患者36例，年齡18～70歲。設(shè)置對(duì)照組：(27例)均為健康志愿者，男性或女性，年齡20～65歲。本研究符合醫(yī)學(xué)研究倫理準(zhǔn)則(赫爾辛基宣言)。

1.1.1 入選標(biāo)準(zhǔn)包括 參照2005年9月在阿姆斯特丹舉行的急性腎衰竭(ARF)國(guó)際研討會(huì)提出的急性腎損傷(AKI)定義(診斷標(biāo)準(zhǔn))是指由導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)或功能變化的損傷引起的腎功能突然(48 h以內(nèi))下降，表現(xiàn)為血肌酐(Cr)絕對(duì)值增加≥0.3 mg/dl(≥26.4 μmol/L)，或者增加≥50%(達(dá)到基線值的1.5倍)，或者尿量 ＜ 0.5 ml/(kg·h)，持續(xù)超過(guò)6 h。并將AKI分為1、2、3期，分別為急性腎損傷1期(危險(xiǎn)期)：血清肌酐升高≥0.3 mg/dL(26.4 μmol/L)或?yàn)榛€值的1.5～2倍;或者尿量＜0.5 ml/(kg·h)，持續(xù)＞6 h。急性腎損傷2期(損傷期)：血清肌酐升高至基線值的2～3倍;或者尿量＜0.5 ml/(kg·h)，持續(xù)＞12 h。急性腎損傷3期(衰竭期)：血清肌酐升高至基線值的3倍或在血清肌酐＞4 mg/dl(354 μmol/L)基礎(chǔ)上急性增加0.5 mg/dL(44 μmol/L);或者尿量＜0.3 ml/(kg·h)持續(xù)＞24 h或無(wú)尿持續(xù)＞12 h。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①有慢性腎病病史者。②雖無(wú)腎病病史但住院體檢發(fā)現(xiàn)腎功能異常者。③有糖尿病，紅斑狼瘡及腎腫瘤病史者。④已發(fā)生多臟器功能衰竭再出現(xiàn)休克者。

1.2 方法 患者住院期間行腎損傷標(biāo)志物包括尿、血、組織檢測(cè)或影像學(xué)方面的檢測(cè)，同時(shí)記錄尿量，確定符合新發(fā)的急性腎損傷的患者。動(dòng)態(tài)觀察腎損傷患者各項(xiàng)指標(biāo)，按照分期系統(tǒng)進(jìn)行分期(AKI 1期、AKI 2期、AKI 3期)，檢測(cè)AKI患者各期與對(duì)照組，使用ELISA檢血HSP70、尿HSP70、血TNF-α、血IL-1等因子，應(yīng)用BeckmanDUC28型自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清 BUN、Cr。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)用±s表示，兩組間比較使用獨(dú)立樣本t經(jīng)驗(yàn)，多組間相互比較采用方差分析，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 基本特征 對(duì)照組和與急性腎損傷患者年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)在相互之間的分別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 生化指標(biāo) AKI患者各期血HSP70、尿HSP70、血BUN、血Cr顯著性高于對(duì)照組(P＜0.05)，AKI 3期血 HSP70、尿HSP70、血BUN、血Cr高于AKI 1期比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05。AKI患者各期 TNF-α、IL-1顯著性高于對(duì)照組(P＜0.05)。AKI 3期血TNF-α、IL-1濃度低于AKI 1期比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05見(jiàn)表1。

表1 急性腎損傷患者各期與對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)分析(±s)

表1 急性腎損傷患者各期與對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)分析(±s)

注：*與對(duì)照組比較P＜0.05，＊＊與AKI1期比較P＜0.05

類別 組數(shù) 血HSP70(ng/ml) 尿hsp70(ng/ml) BUN(mmol/L) Cr(μmol/L) TNF-α(pg/ml) IL-1(pg/ml)對(duì)照組 27 4.52±1.24 2.13±1.02 5.25±1.24 68.6±13.5 8.17±2.11 54.12±13.5 AKI 1 36 12.57±2.36* 4.56±2.12* 10.33±3.64* 125.8±24.7* 63.23±13.35* 136.76±56.27*AKI 2 36 15.67±3.28* 7.62±2.14* 15.72±6.75* 186.7±37.5* 50.12±10.32* 110.32±35.46*AKI 3 36 22.68±4.78＊＊ 10.34±3.14＊＊ 23.82±5.44＊＊ 328.6±62.5＊＊ 20.34±7.14＊＊ 80.43±28.32＊＊

2.3 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果 急性腎損傷患者在急性損傷期血HSP70與血BUN、血Cr、尿HSP70呈正相關(guān)(r=0.826，P＜0.05;r=0.923，P ＜0.05;r=0.872，P ＜0.05.)，與 TNF-α、IL-1炎性因子呈負(fù)相關(guān)(r=-0.927，P＜0.05 r=-0.783，P＜0.05.)。

3 討論

熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)又稱應(yīng)激蛋白，是生物體內(nèi)或離體細(xì)胞產(chǎn)生的一組具有高度保守性的蛋白質(zhì)，目前已發(fā)現(xiàn)10多種，根據(jù)分子量的不同，可將HSP分為HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族和泛醌輔酶 Q等。誘導(dǎo)HSP產(chǎn)生的因素很多，大致分為以下三類：①環(huán)境性應(yīng)激因素，物理性損傷如熱、有機(jī)物、氧化劑、某些藥物等。②病理生理性應(yīng)激因素，微生物感染、組織損傷、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子等。③正常情況下細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、胚胎發(fā)育等。HSP一般不直接發(fā)揮生物學(xué)作用，而是通過(guò)幫助新生蛋白質(zhì)的正確折疊、移位、維持和受損蛋白質(zhì)的修復(fù)、移除、降解，在應(yīng)激的不利條件下，提高細(xì)胞的抵抗力，起到應(yīng)激保護(hù)作用，HSP的生物學(xué)功能可歸納為以下幾個(gè)方面：①分子伴侶作用：HSP與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，協(xié)助與其結(jié)合的蛋白質(zhì)維持構(gòu)象，參與蛋白質(zhì)的變構(gòu)、轉(zhuǎn)運(yùn)及降解，而自身不參與蛋白質(zhì)組成，在應(yīng)激狀態(tài)下，與變性蛋白質(zhì)結(jié)合，促進(jìn)其修復(fù)或消除，在維持受損細(xì)胞的生存和功能中更是發(fā)揮重要作用。②抗氧化作用：具有抗氧化的生物活性，通過(guò)抑制產(chǎn)生氧自由基的關(guān)鍵酶即還原型輔酶氧化酶，減少氧自由基的產(chǎn)生和增加內(nèi)源性抗氧化劑加速氧自由基的清除兩方面降低細(xì)胞內(nèi)的氧自由基，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷［4-6］。③抗凋亡作用：研究已證實(shí)，HSP70、HSP60均可通過(guò)干擾引起凋亡調(diào)節(jié)蛋白激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而減少組織的損傷，促進(jìn)應(yīng)激損傷的恢復(fù)。④協(xié)同免疫應(yīng)答：HSP具有類似主要組織相容性復(fù)合物結(jié)合抗原肽的結(jié)構(gòu)域，結(jié)合抗原肽形成HSP-肽復(fù)合物，保護(hù)抗原肽免受酶降解，并通過(guò)自身ATP酶活性及可能的蛋白酶活性對(duì)其結(jié)合的前體抗原肽分子進(jìn)行修剪，或者由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔外肽酶進(jìn)行修剪，使抗原膚適合與分子結(jié)合，輔助抗原呈遞，增強(qiáng)免疫應(yīng)答。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于HSP70細(xì)胞內(nèi)表達(dá)規(guī)律的認(rèn)識(shí)在不斷深化，近年研究表明，結(jié)構(gòu)型HSP70(HSP73)在正常腎組織有一定量的表達(dá)，經(jīng)過(guò)應(yīng)激或缺血/缺氧后，細(xì)胞內(nèi)HSP70合成機(jī)制被啟動(dòng)，誘導(dǎo)型HSP70(HSP72)合成將顯著增加，并增強(qiáng)機(jī)體對(duì)隨后進(jìn)一步損傷的抵抗功能。Martinez等［7］對(duì)HSP70的基因結(jié)構(gòu)及調(diào)控作過(guò)較多的研究，認(rèn)為當(dāng)細(xì)胞應(yīng)激后，細(xì)胞內(nèi)未折疊或變性蛋白增多，啟動(dòng)熱體克蛋白基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)而合成HSP70。本研究對(duì)象中急性腎損傷中血、尿HSP70濃度明顯高于對(duì)照組，研究表明，腎組織缺血時(shí)，HSP70表達(dá)上調(diào)。張鴻彥等［8］在慶大霉素引起的急性腎小管損傷中，腎組織HSP73(結(jié)構(gòu)型HSP70)的表達(dá)也上調(diào)，并且腎小管上皮細(xì)胞中HSP73重新分布，由細(xì)胞核向細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移。HSP具有細(xì)胞保護(hù)作用，并參與損傷的修復(fù)過(guò)程。亞砷酸鈉、小劑量環(huán)胞菌素A、短暫輸尿管結(jié)扎等均可誘導(dǎo)HSP70的表達(dá)上調(diào)，對(duì)隨后的缺血/再灌注或腎毒藥物引起的腎組織損傷有明顯的保護(hù)作［9-11］。此外，國(guó)內(nèi)周立文等［12］有報(bào)道在相同性質(zhì)但程度不同的應(yīng)激條件下，HSP70的合成將隨損傷程度的加深而增加。本研究對(duì)象中急性腎損傷中血、尿HSP70在AKI3期較AKI 1期明顯增多有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，血HSP70與血BUN、血Cr正相關(guān)說(shuō)明HSP70升高可能與腎組織的腎損傷成正比，這與McCabe等［13］曾報(bào)道整體動(dòng)物熱應(yīng)激后組織損傷的程度與IISP70陽(yáng)性顯成正比相一致。

急性腎損傷的患者有大量活性氧族(ROS)，淋巴細(xì)胞釋放細(xì)胞因 IL-1，IL-2，IL-8及 TNF-α等，ROS及細(xì)胞因子上調(diào)HSP，激活 HSP基因，增強(qiáng) HSP的表達(dá)，使血漿中 HSP70的表達(dá)繼續(xù)上升達(dá)高峰。較早出現(xiàn)的高表達(dá)的 HSP70通過(guò)發(fā)揮其“分子伴侶”作用，抗氧化、抗細(xì)胞凋亡、抗炎癥損傷，參與細(xì)胞保護(hù)等內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制對(duì)腎組織起保護(hù)作用，促進(jìn)了腎功能的恢復(fù)，本實(shí)驗(yàn)研究研究與血HSP70與TNF-α、IL-1炎性因子呈負(fù)相關(guān)?？赡蹾SP70的升高抑制炎癥因子的表達(dá)，從而對(duì)減少對(duì)細(xì)胞的損傷。一些研究表HSP70表達(dá)增加有明顯的抗炎癥作用，HSP70的抗炎癥作用與其抑制NF-kB的活性，減少炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，以及增加抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)有關(guān)。NF-κB與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，HSP70可抑制TNF-α和IL-1β對(duì) NF-kB的激活，進(jìn)而抑制 TNF-α和 IL-8的表達(dá)［14］。

綜上所述，急性腎損傷HSP70表達(dá)增多反映腎損傷的嚴(yán)重程度，同時(shí)HSP70表達(dá)可能抑制炎癥因子的的激活，啟動(dòng)了內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，利于腎臟損傷的修復(fù)。

［1］馬宏仲，薛榮亮.熱休克蛋白與腦缺血再灌注損傷．國(guó)外醫(yī)學(xué)麻醉學(xué)與復(fù)蘇分冊(cè)，2004，25(1)：20-21．

［2］王占明，曾建國(guó)，賴大年，等.熱休克蛋白與肝臟缺血預(yù)處理延遲保護(hù)作用．第四軍醫(yī)大學(xué)，2001，22(13)：1200-1203．

［3］王峰，尚立芝，曹珊，等.參附注射液預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷后 HSP70基因表達(dá)的影響．河南中醫(yī)學(xué)院院報(bào)，2007，22(128)：36-38．

［4］Suzuki S，Maruyama S，Sato W，et al.Geranylgeranylacetone ameliorates ischemic acute renal failure via induction of Hsp70．Kidney Int，2005，67(6)：2210-2220．

［5］Barisic K，Petrik J，Rumora L，et al.Expression of Hsp70 in kidney cells exposed to ochratoxin A．Arch Toxicol，2002，76(4)：218-226．

［6］李峰.熱休克蛋白70的免疫學(xué)進(jìn)展．陜西醫(yī)學(xué)雜志，2004，33(4)：352-356．

［7］Martinez BMA，Dey A，Rabindran SK，et al.Displancement of sequence-specific transcription factor from miotc chromatin.Cell，1995，83(1)：29．

［8］張鴻彥，孫玲娣，趙達(dá)亞.慶大霉素誘導(dǎo)急性腎損傷大鼠腎臟熱休克蛋白70的表達(dá).實(shí)用兒科臨床雜志，2007，22(5)：333-335．

［9］丁弘，劉殿閣.不同類型熱休克蛋白在腎臟疾病中作用.臨床薈萃，2008，23(18)：1366-1367．

［10］張鴻彥，趙達(dá)亞，孫玲娣.環(huán)胞霉素A誘導(dǎo)急性腎損傷大鼠腎臟熱休克蛋白70的表達(dá).哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，41(2)：136-139．

［11］Zhang PL，Lun M，Schworer CM，et al.Heat shock protein expression is highly sensitive to ischemia-reperfusion injury in rat kidneys.，Ann Clin Lab Sci，2008，38(1)：57-64．

［12］周立文，王焱林，萬(wàn)德寧．不同劑量氯胺酮對(duì)大鼠腦組織熱休克蛋白70表達(dá)的影響．中華麻醉學(xué)雜志，1999，29(2)：118．

［13］McCabe T，Simon-RP.Hyperthermia induces 72kDa heat shock protein expression in rat brain in non-neuronal cells.Neurosci Lell，1993，159(1-2)：163．

［14］Yamamoto Y，Kume M，Yamaoka Y，et al.Implications of heat shock proteins during liver surgery and liver perfusion．Recent Results Cancer Res，1998，147157-147172．