納秒脈沖誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞縫隙連接通訊恢復(fù)的實驗研究

姚陳果 郭 飛 李成祥 肖德友 唐麗靈

1(重慶大學(xué)輸配電裝備及系統(tǒng)安全與新技術(shù)國家重點實驗室，重慶 400030)

2(重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶 400030)

引言

多細(xì)胞生物體內(nèi)的正常細(xì)胞之間是相互連接、相互溝通的協(xié)同作用組織方式。細(xì)胞通訊，是指一個細(xì)胞發(fā)出的信息通過介質(zhì)傳遞到另一個細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)反應(yīng)的過程[1-3]。細(xì)胞通訊有 3種主要方式[4]：細(xì)胞間接觸性依賴的通訊、化學(xué)通訊和細(xì)胞間縫隙連接通訊(gap junctional intercellular communication，GJIC)，其中 GJIC是細(xì)胞間的直接通訊方式。GJIC由聚焦的通道組成[5-7]，通道的直徑約為3 nm，包括由相鄰細(xì)胞提供的兩個半通道，每個半通道(連接子)由屬于連接蛋白基因家族的6個蛋白亞基組成，它的通道只允許分子量小于1×103的小分子通過，如無機鹽、糖、氨基酸和維生素等，而核糖、多糖、蛋白質(zhì)等大分子不能通過[8];間隙連接在代謝偶聯(lián)、神經(jīng)信號傳輸、早期胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化中發(fā)揮了巨大的作用。細(xì)胞之間的間隙連接是凋亡信號的傳輸通道，能夠促進細(xì)胞凋亡。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞由于GJIC功能異常，所以無法產(chǎn)生接觸抑制從而誘發(fā)凋亡[9-11]。因此，利用物理的手段恢復(fù)腫瘤細(xì)胞間隙連接，可以成為促進腫瘤細(xì)胞的凋亡的因素。

目前，電場脈沖對細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響與對生物體的治療作用逐漸成為生物電磁技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點[12-13]，它不僅為電氣工程師、細(xì)胞生物學(xué)家和臨床醫(yī)師等通過強大而簡潔的電場方式(類似于“探針”)研究細(xì)胞內(nèi)外膜跨膜電位變化并調(diào)控生物細(xì)胞響應(yīng)開辟了一條全新途徑，而且也為納秒脈沖靶向作用于細(xì)胞膜或線粒體跨膜電位從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡提供了可能，并展示出良好的發(fā)展前景。

長期以來，國內(nèi)外同行專家們在此領(lǐng)域做了大量的實驗和理論研究工作，取得了初步的成效和具有臨床實用價值的結(jié)果。Schoenbach、Joshi等發(fā)現(xiàn)，不用化療藥物，采用場強為100 kV/cm左右、脈寬為10 ns級的納秒脈沖，可以改變細(xì)胞器的跨膜電位，進而導(dǎo)致一系列被稱為“內(nèi)處理效應(yīng)”(electromanipulation)的細(xì)胞反應(yīng)[14-16];Nuccitelli等發(fā)現(xiàn)，脈寬為300 ns、場強為40 k V/cm的納秒脈沖可以完全殺死實驗鼠的皮膚瘤[17];Beebe等對納秒脈沖誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡時的細(xì)胞膜跨膜電位變化和細(xì)胞色素C及caspase等的釋放情況進行了研究[18-20];Weaver等認(rèn)為，納秒脈沖通過改變線粒體跨膜電位，進而促使線粒體的通透性轉(zhuǎn)換孔不可逆開放，最終引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡[21];Schoenbach等研究表明，不同脈寬的納秒脈沖通過不同途徑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[22-23]，Beebe進一步的研究揭示，300 ns的納秒脈沖可以通過死亡受體途徑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[24]。國內(nèi)的研究者對納秒脈沖的生物電效應(yīng)機制也開展了大量的研究工作，肖登明等和嚴(yán)萍等對納秒脈沖的內(nèi)處理效應(yīng)進行了初步研究[25-26]，重慶大學(xué)從2003年起，就對納秒脈沖的生物電效應(yīng)及其作用機理做了大量的研究[27-30]，同時揭示了納秒脈沖誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的線粒體凋亡通路[31]。

雖然國內(nèi)外眾多學(xué)者對納秒脈沖的生物電效應(yīng)作用機制及其臨床應(yīng)用進行了大量的研究，但納秒脈沖靶向誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機制尚不清楚，而腫瘤細(xì)胞的凋亡與其GJIC的功能變化密切相關(guān)，因此本課題對納秒脈沖作用后腫瘤細(xì)胞的GJIC功能變化進行了研究，以期進一步深化納秒脈沖誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機制研究，目前國內(nèi)外尚無此方面的報道。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗用細(xì)胞系為人肝癌細(xì)胞株Hep-G2(購于中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所)。以RPMI1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含有10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(購于天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)、100μg/mL青霉素(購于華北制藥股份有限公司)、100μg/mL鏈霉素(購于華北制藥股份有限公司)，置于37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱的常規(guī)培養(yǎng)。實驗時，用 0.25%的胰蛋白酶和0.02%EDTA(美國 GIBCO公司)消化培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，血球計數(shù)板計數(shù)，將1×105～1×106個細(xì)胞接種在自行設(shè)計的電極腔板里(見圖1)，培養(yǎng)24 h，用做實驗。電極腔板以蓋玻片作為底板，鉑金片(寬40 mm×高10 mm×厚0.5 mm)作為電極，玻璃(寬5 mm×高10 mm×厚1 mm)作為另兩面腔板。細(xì)胞懸液置于由上述三者所包圍的20 mm×10 mm×5 mm的腔內(nèi)，脈沖電場通過電極施加于細(xì)胞懸液。

圖1 電極腔板(1—蓋玻片，作為底板;2—鉑金電極;3—玻璃)Fig.1 Electrode chamber(1—cover glass，as base plate;2—platinized electrodes;3—glass)

1.2 納秒脈沖樣機

樣機為重慶大學(xué)輸配電裝備與系統(tǒng)安全及新技術(shù)國家重點實驗室自行開發(fā)。樣機參數(shù)：輸出脈沖電壓峰值可達(dá)5 k V，脈寬500 ns，頻率為1 Hz。實驗時用美國Tektronix TDS3032 B示波器，實時觀察輸出的脈沖波形，如圖2所示。

圖2 脈沖電壓波形Fig.2 sFull waveform of electric pulse

1.3 實驗方法

1.3.1 納秒脈沖處理

實驗設(shè)置為3組：A組為對照組，不進行電刺激;B組和C組施加脈沖電場處理。實驗分組及各組的詳細(xì)納秒脈沖電場參數(shù)如表1所示。所有實驗重復(fù)至少3次，將細(xì)胞溶液置于電極腔板內(nèi)，即可接受電刺激。

表1 納秒脈沖電場參數(shù)Tab.1 Parameters of applied nsPEF

1.3.2 熒光漂白恢復(fù)(FRAP)技術(shù)

實驗用熒光染料：5，6-羥基熒光素乙酸乙酰鹽(5，6-CFDA)，包括以下步驟。

步驟1：熒光負(fù)載細(xì)胞。培養(yǎng)好的細(xì)胞(腔板接種培養(yǎng)24 h，生長良好)經(jīng)電刺激后，熒光染料孵育15 min，PBS清洗兩次，去除環(huán)境殘余，PBS浸潤待用。

步驟2：測定熒光漂白恢復(fù)率。隨機選擇與周圍其他細(xì)胞緊密相鄰的細(xì)胞，熒光萃滅的激光能量強度為81%，漂白脈沖時間10 s，漂白后每5 s激光共聚焦掃描顯微鏡掃描攝像一次，獲取掃描圖像，得到漂白細(xì)胞熒光的恢復(fù)及相鄰接觸的未漂白細(xì)胞熒光的動態(tài)變化情況，數(shù)據(jù)用于曲線擬合。

步驟3：計算熒光漂白恢復(fù)率 Kt。Kt=(FF0)/(Fi-F0)[32]。其中，F(xiàn)為 t時刻萃滅細(xì)胞的熒光強度，F(xiàn)0為萃滅瞬間的熒光強度，F(xiàn)i為萃滅前的熒光強度。

2 結(jié)果

2.1 納秒脈沖處理后熒光強度的變化情況

在納秒脈沖作用后，不同采樣的細(xì)胞萃滅后熒光強度的變化情況如圖3所示(縱坐標(biāo) If/a.u.表示熒光強度，萃滅前均為220左右，圖中未顯示)。對照組腫的瘤細(xì)胞萃滅后，熒光即刻降低，隨著時間的推移，并未出現(xiàn)熒光恢復(fù)(見圖3(a));脈沖處理組的B組和 C組，細(xì)胞萃滅后熒光即刻降低，且隨著時間的推移，熒光強度出現(xiàn)上升，表明處理組腫瘤細(xì)胞間縫隙連接通訊得到恢復(fù)，與周圍細(xì)胞進行物質(zhì)交換。對比實驗組B和C亦可發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞間縫隙連接通訊的恢復(fù)情況與電刺激時間(即施加脈沖個數(shù))相關(guān)。

圖3 不同采樣的細(xì)胞萃滅后熒光強度的變化曲線。(a)對照組;(b)實驗組B;(c)實驗組CFig.3 Changes of fluorescence intensity before and after cancellation in tumor cells with different sampling.(a)Control group;(b)Group B;(c)Group C

2.2 納秒脈沖處理后熒光漂白恢復(fù)率

為了更好地說明納秒脈沖處理后腫瘤細(xì)胞間縫隙連接通訊的恢復(fù)情況，計算了Hep-G2細(xì)胞熒光漂白恢復(fù)率，結(jié)果如圖4所示。與對照組相比，實驗組B和C均表現(xiàn)出較高的熒光漂白恢復(fù)率，且C組熒光漂白恢復(fù)率明顯高于B組。B組的熒光漂白恢復(fù)率隨時間推移而增加，最后出現(xiàn)飽和。在有限的觀察時間內(nèi)，C組的熒光漂白恢復(fù)率一直增加，并未出現(xiàn)飽和。

圖4 Hep-G2D細(xì)胞熒光漂白恢復(fù)率。(a)對照組;(b)實驗組B;(c)實驗組CFig.4 Rate of fluorescence recovery after photobleaching in Hep-G2 cells.(a)Control group;(b)Group B;(c)Group C

3 討論

Loewenstein和 Kanno在1966年首次發(fā)現(xiàn)GJIC的現(xiàn)象，Loewenstein及其同事隨后發(fā)現(xiàn)惡變的成纖維細(xì)胞缺乏GJIC的功能。越來越多的實驗結(jié)果[33]證明，幾乎所有人類腫瘤都存在GJIC的缺失，而恢復(fù)GJIC可降低腫瘤形成的幾率，可見GJIC與癌癥的發(fā)生存在著必然的聯(lián)系。因此人們認(rèn)為，恢復(fù)腫瘤細(xì)胞間或腫瘤細(xì)胞和對應(yīng)正常細(xì)胞間的GJIC功能，可能會使其表型正?；?，并且推測在腫瘤的始發(fā)階段防止GJIC的下調(diào)及在腫瘤發(fā)生后恢復(fù) GJIC，是腫瘤預(yù)防與治療潛在的靶點之一。首先，人們使用化學(xué)手段，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞間恢復(fù)GJIC。一些抗癌物質(zhì)(如維生素D、類胡蘿卜素、類維生素A、cAMP)可以增強 GJIC，起到一定的腫瘤預(yù)防作用?；瘜W(xué)手段誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞間恢復(fù)GJIC，可以在一定程度上抑制腫瘤增長及轉(zhuǎn)移等，但不能清除腫瘤細(xì)胞，若應(yīng)用于臨床，需與化療及周期特殊性抑癌藥物聯(lián)合使用[34]。隨著連接蛋白基因的獲得，人們將連接蛋白cDNA轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞中，可使無GJIC的腫瘤細(xì)胞趨于正常化。但這種方法存在細(xì)胞選擇性，難以消除腫瘤細(xì)胞。近年來的研究揭示，細(xì)胞之間的間隙連接是凋亡信號的傳輸通道，能夠促進細(xì)胞凋亡;與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞由于GJIC功能異常，所以無法產(chǎn)生接觸抑制，從而誘發(fā)凋亡。因此，利用物理的方法恢復(fù)腫瘤細(xì)胞間隙連接，可以成為促進腫瘤細(xì)胞凋亡的有效手段。而研究結(jié)果表明，納秒脈沖可以有效促進腫瘤細(xì)胞GJIC的恢復(fù)，進而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，這與以往的納秒脈沖生物電效應(yīng)研究相符，也為納秒脈沖用于GJIC障礙性疾病的治療提供一條全新的途徑。

納秒脈沖獨特的靶向誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的生物電效應(yīng)引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛興趣。研究者們從凋亡途徑、量效關(guān)系、模型分析等角度對納秒脈沖靶向誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機制進行了探討。但由于研究角度的局限性，納秒脈沖誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機制尚未完全揭示。以往的研究基于單細(xì)胞模型，從跨膜電位角度揭示納秒脈沖誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機制[35]：當(dāng)施加納秒脈沖于細(xì)胞時，細(xì)胞膜或細(xì)胞器(線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等)膜的跨膜電位發(fā)生崩潰，進而從內(nèi)源性或外源性凋亡途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。上述研究從單細(xì)胞角度研究腫瘤細(xì)胞的凋亡，而未納入多細(xì)胞生物體的細(xì)胞通訊研究，尤其是細(xì)胞間縫隙連接通訊(GJIC)在納秒脈沖誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡中的作用。因此，從腫瘤細(xì)胞GJIC功能變化角度研究納秒脈沖靶向誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡機制，不失為一個很好的方向。同時，本研究表明，納秒脈沖可以有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞GJIC的恢復(fù)，為納秒脈沖誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機制研究提供一個全新的方向。

研究結(jié)果表明，納秒脈沖可以促進腫瘤細(xì)胞GJIC功能的恢復(fù)，并且恢復(fù)的速率與施加的納秒脈沖個數(shù)正相關(guān)，這在一定程度上揭示了納秒脈沖靶向誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡與腫瘤細(xì)胞GJIC的恢復(fù)密切相關(guān)。上述研究不僅深化了納秒脈沖誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機制研究，而且為GJIC障礙疾病提供了一個新的治療途徑。隨著時間的推移，納秒脈沖處理組熒光恢復(fù)率達(dá)到對照組的3倍以上，但具體兩者如何聯(lián)系起來以及關(guān)聯(lián)程度如何卻不得而知。同時，本研究采用的納秒脈沖場強、脈寬等固定參數(shù)發(fā)生變化時，腫瘤細(xì)胞間GJIC的恢復(fù)狀況是否發(fā)生改變以及如何改變，此外上述研究結(jié)果是否存在細(xì)胞特異性，當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)及類型發(fā)生變化時又會是怎樣的結(jié)果，這將是下一步研究工作的重點。

4 結(jié)論

將納秒脈沖作用于人肝癌細(xì)胞(Hep-G2)，通過熒光漂白恢復(fù)(FRAP)技術(shù)，檢測熒光萃滅后腫瘤細(xì)胞的熒光強度變化情況。實驗結(jié)果表明，納秒脈沖作用可以促進腫瘤細(xì)胞 GJIC功能的恢復(fù)，且GJIC對納秒脈沖作用的響應(yīng)程度與施加的脈沖個數(shù)有關(guān)。

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