母胎界面MCP－1表達(dá)異常與不明原因早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的關(guān)系

張 鈺 李俊霞 顧 艷 李 奕

天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院計劃生育科(300211)

早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(ERSA)發(fā)病率為3% ～5%。排除臨床上可明確的病因(染色體、解剖、內(nèi)分泌及感染因素)，仍有近1/2的ERSA病因未明，稱不明原因早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(UERSA)。隨著生殖免疫學(xué)的發(fā)展，逐步認(rèn)識到UERSA是一種同種免疫病，其發(fā)病可能是由于母胎界面種植部位局部細(xì)胞功能的異常和細(xì)胞因子的分泌異常［1］，但導(dǎo)致UERSA的具體發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。單核細(xì)胞趨化蛋白 －1(MCP－1)是在體外最早發(fā)現(xiàn)的具有趨化活性的細(xì)胞因子之一，屬于趨化因子家族。文獻(xiàn)已證實早孕絨毛和蛻膜組織中均有MCP－1的表達(dá)，母胎界面產(chǎn)生的MCP－1與蛻膜局部的單核巨噬細(xì)胞的募集與激活有關(guān)［2，3］，但其與UERSA發(fā)病的研究尚未見報道。本研究通過篩選UERSA患者，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT－PCR)和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法，研究UERSA患者絨毛和蛻膜組織中MCP－1 mRNA的表達(dá)異常及血清MCP－1的蛋白含量與UERSA發(fā)病的相關(guān)性，為臨床建立有效的監(jiān)測指標(biāo)和成功的治療方案提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象

在知情同意下，選擇2008年6月～2009年6月在天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院計劃生育科就診的UERSA患者30例(UERSA組)，超聲檢查提示胚胎發(fā)育停止或孕卵枯萎，無胎心搏動。UERSA患者應(yīng)符合以下診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］:①與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生至少2次自然流產(chǎn)，流產(chǎn)孕周為7～12周;②夫婦外周血染色體核型均正常;③生殖器官解剖結(jié)構(gòu)未見異常;④內(nèi)分泌激素(如性激素、血糖、胰島素水平和甲狀腺功能)均正常;⑤血清TORCH－IgM檢測陰性，宮頸分泌物衣原體、解脲支原體檢測均為陰性;⑥自身抗體陰性(外周血抗心磷脂抗體陰性，抗β2－糖蛋白1抗體陰性，狼瘡抗凝物陰性)。同期隨機(jī)收集自愿要求終止妊娠的健康早孕婦女30例為對照組，無自然流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)等不良孕產(chǎn)史，孕周7～12周，B超提示胚胎發(fā)育正常，本次妊娠期間無陰道流血、腹痛等先兆流產(chǎn)的癥狀和體征，未放置宮內(nèi)節(jié)育器。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及處理所有受試對象完善血常規(guī)、心電圖、白帶常規(guī)等各項檢查，未發(fā)現(xiàn)異常后行負(fù)壓吸宮手術(shù)。手術(shù)前采集肘靜脈血5ml，室溫靜置2h后，2 500r/min離心15min，取上清液放入凍存管，置于－80℃冰箱凍存待測。手術(shù)后，無菌條件下選取絨毛、蛻膜組織約0.3g，立刻用焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的無菌磷酸鹽緩沖液漂洗，置于凍存管封存，液氮保存。

1.2.2 實時熒光定量RT－PCR技術(shù)檢測絨毛、蛻膜組織中MCP－1 mRNA的表達(dá)①主要試劑:RNAiso Plus、RT－PCR試劑盒、熒光染料SYBR Green購自大連寶生物工程有限公司。熒光定量PCR儀:LightCycler(Roche公司)。②引物的設(shè)計和合成:根據(jù)Gen-Bank所發(fā)布的基因序列，由天津六合通生物技術(shù)有限公司設(shè)計和合成。MCP－1上游引物序列:5'－CAATCAATGCCCCAGTCACC－3'，下游引物序列:5'－CCTGAACCCACTTCTGCTTG－3'。選擇 β －actin為內(nèi)參照基因，其上游引物序列:5'－GCAAAGACCTGTACGCCAAC－3'，下游引物序列5'－ACATCTGCTGGAAGGTGGAC－3'。③絨毛、蛻膜組織中MCP－1 mRNA的檢測:提取絨毛、蛻膜組織總RNA，按RTPCR試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。實時熒光定量RT－PCR總反應(yīng)體系為:cDNA模板1μl，上、下游引物各 0.3μl，SYBY Green 染料 10μl，用雙蒸水補足至20μl。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性10s，95℃變性5s、60℃退火20s、72℃延伸10s，共40 個循環(huán)，并且做熔解曲線和擴(kuò)增曲線分析。④數(shù)據(jù)分析:根據(jù)Livak和Schmittgen［5］設(shè)計的比較閾值法來測定目的基因的相對表達(dá)，目的基因的相對表達(dá)量=2－△△Ct。

1.2.3 血清MCP－1蛋白含量測定Human MCP－1 ELISA測定試劑盒由美國R＆D公司提供，嚴(yán)格按說明書操作。用Model 680酶標(biāo)儀(Sanyo，Japan)在450nm波長依序測量各孔的OD值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算出相應(yīng)的MCP－1濃度。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析所得數(shù)據(jù)以±s的形式表示，應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS 11.0分析處理，計量資料分析采用Student－t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 兩組婦女臨床相關(guān)指標(biāo)比較

UERSA組和正常早孕組的年齡、孕次、停經(jīng)天數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，具有可比性。UERSA組因為胚胎停育，胎囊小于正常早孕組(＜0.05)。見表1。

2.2 早孕絨毛、蛻膜組織MCP－1mRNA的表達(dá)

本實驗采用實時熒光定量RT－PCR技術(shù)，MCP－1基因的熔解曲線和擴(kuò)增曲線見圖1、2。熔解曲線提示本實驗?zāi)康幕驍U(kuò)增的特異性較高，擴(kuò)增曲線提示本實驗擴(kuò)增質(zhì)量良好。實驗結(jié)果表明正常早孕婦女和UERSA患者絨毛、蛻膜組織均可見MCP－1mRNA的表達(dá)，絨毛、蛻膜組織MCP－1與內(nèi)參基因β－actin濃度比值分別為1.68 ±0.42，2.30 ±0.86，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

2.3 兩組絨毛、蛻膜組織中MCP－1 mRNA的表達(dá)量和血清中MCP－1蛋白含量的比較

UERSA組絨毛和蛻膜組織中MCP－1 mRNA的表達(dá)量均顯著高于正常早孕組(P＜0.01);UERSA組血清中MCP－1蛋白的含量顯著高于正常早孕組(P ＜0.01)。見圖3、4。

表1 兩組研究對象一般情況比較(±s)

表1 兩組研究對象一般情況比較(±s)

＊與UERSA組比較P＜0.05

組別 例數(shù) 年齡(歲) 孕次 停經(jīng)天數(shù) 胎囊大小(mm)UERSA 組 30 28.42 ±4.55 3.94 ±0.56 75.23 ±6.05 34.34 ±6.95正常早孕組 30 27.63 ±4.16 3.06 ±0.85 72.46 ±6.53 48.41 ±3.30*

2.4 血清MCP－1蛋白含量與絨毛、蛻膜組織中MCP－1mRNA表達(dá)量的相關(guān)性

UERSA組和對照組血清中MCP－1蛋白含量與絨毛組織中MCP－1 mRNA的表達(dá)量之間呈正相關(guān)(r=0.595，P ＜0.05)，與蛻膜組織中 MCP－1mRNA的表達(dá)量之間也呈正相關(guān)(r=0.655，P＜0.05)，見圖 5、6。

3 討論

3.1 母胎界面MCP－1的表達(dá)與正常早期妊娠的維持

從免疫學(xué)角度而言，自然妊娠是一種特殊類型的“半同種異體移植”。胚胎種植的免疫過程受胚胎和母體兩方面的共同調(diào)節(jié)，發(fā)生在母胎界面的免疫反應(yīng)使胚胎能夠成功侵入子宮內(nèi)膜并使子宮內(nèi)膜的血管發(fā)生重鑄，從而使胚胎能夠從母體得到良好的血液供養(yǎng)而發(fā)育成熟［6］。母胎界面的胎兒面主要由絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞組成，母體－蛻膜面富集著母方來源的免疫活性細(xì)胞，由子宮自然殺傷細(xì)胞(uNK細(xì)胞)、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞組成。已有研究表明，母胎界面局部免疫活性細(xì)胞并非源于前體細(xì)胞在子宮內(nèi)膜的自我更新，而是從外周血中被募集遷移而來的。趨化因子MCP－1在單核－巨噬細(xì)胞的遷移、募集和歸巢中發(fā)揮決定性作用，參與胚胎種植階段母胎界面的免疫反應(yīng)［7，8］。本研究結(jié)果顯示，在早孕絨毛和蛻膜組織中共表達(dá)MCP－1 mRNA，且在蛻膜的表達(dá)高于絨毛，提示MCP－1可能參與復(fù)雜的母胎界面的整合性調(diào)控，在蛻膜巨噬細(xì)胞的招募和遷移中發(fā)揮重要作用。推測胎盤絨毛和蛻膜組織可能通過自分泌和旁分泌MCP－1調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜免疫活性細(xì)胞的功能，從而調(diào)節(jié)母胎免疫耐受，最終成功妊娠。

3.2 絨毛、蛻膜組織中MCP－1mRNA的表達(dá)與UERSA

目前認(rèn)為巨噬細(xì)胞活性和功能的異常是導(dǎo)致母胎免疫耐受失衡、發(fā)生 UERSA 的重要原因［9，10］，病理機(jī)制可能是:①巨噬細(xì)胞被激活后，可造成腫瘤壞死因子(TNF)－α、白介素(IL)－1等炎癥細(xì)胞因子水平升高，高濃度的炎癥細(xì)胞因子可以通過多種途徑導(dǎo)致流產(chǎn)［11］;②巨噬細(xì)胞激活后不能及時清除凋亡的滋養(yǎng)細(xì)胞，凋亡的滋養(yǎng)細(xì)胞蓄積，可引發(fā)針對胎兒抗原的免疫攻擊;③巨噬細(xì)胞激活后可激發(fā)Thl型免疫反應(yīng)，促使母體排斥胚胎組織［12］，最終導(dǎo)致自然流產(chǎn)的發(fā)生。體外試驗研究發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)細(xì)胞與蛻膜接觸時會誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞大量分泌MCP－1，從而吸引外周血中的單核細(xì)胞和蛻膜組織中的巨噬細(xì)胞不斷聚集在種植部位并激活，激活的巨噬細(xì)胞在滋養(yǎng)細(xì)胞的誘導(dǎo)下分泌誘導(dǎo)局部免疫抑制反應(yīng)以及營養(yǎng)胚胎的細(xì)胞因子。如果提升蛻膜組織中MCP－1的濃度，會使巨噬細(xì)胞的招募變得不可抑制，而升高內(nèi)膜中炎癥細(xì)胞因子TNF－α、IL－1等的濃度，均可誘導(dǎo)MCP－1的表達(dá)，這將構(gòu)成一個正反饋放大環(huán)路［13，14］。米亞英等［15］研究發(fā)現(xiàn):自然流產(chǎn)小鼠模型蛻膜組織中MCP－1、TNF － α 的表達(dá)顯著升高，Chaiworapongsa等［16］發(fā)現(xiàn)，羊水中MCP－1水平升高是自然流產(chǎn)的一個危險因素，這些研究均提示MCP－1的表達(dá)與自然流產(chǎn)的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)UERSA組絨毛、蛻膜組織中MCP－1 mRNA表達(dá)量顯著高于正常妊娠組，提示母胎界面MCP－1表達(dá)上調(diào)可能與UERSA的發(fā)病有關(guān)，MCP－1參與了自然流產(chǎn)過程。推測MCP－1可能是巨噬細(xì)胞參與母胎界面免疫反應(yīng)的始動因素，母胎界面MCP－1表達(dá)上調(diào)，直接導(dǎo)致了巨噬細(xì)胞的數(shù)量和免疫活性異常，數(shù)量增多、功能增強(qiáng)的巨噬細(xì)胞再分泌大量的MCP－1，誘導(dǎo)更多巨噬細(xì)胞聚集，由此產(chǎn)生級聯(lián)放大作用，發(fā)揮免疫效應(yīng)，可能是最終導(dǎo)致胚胎死亡的重要機(jī)制。

3.3 血清MCP－1蛋白含量和絨毛、蛻膜組織中MCP－1－mRNA表達(dá)的相關(guān)性及意義

胚胎發(fā)育停止在臨床上屬于稽留流產(chǎn)的范疇，如不及時診斷、治療，胚胎可發(fā)生機(jī)化，與子宮壁粘連，在清宮術(shù)中易導(dǎo)致子宮穿孔、吸宮不全、子宮出血、感染等嚴(yán)重的并發(fā)癥，增加清宮手術(shù)的難度。目前對妊娠早期胚胎發(fā)育的監(jiān)測主要通過超聲檢查和血清人絨毛膜促性腺激素(hCG)的測定來完成，B超下孕卵形態(tài)或位置的改變，胎心的消失，血hCG的明顯降低都能較準(zhǔn)確地指示流產(chǎn)的發(fā)生。然而B超和血hCG測定預(yù)測胚胎發(fā)育不良仍有一些不足之處，當(dāng)患者停經(jīng)天數(shù)較少、月經(jīng)不規(guī)律、B超未見胚胎心管搏動時，僅憑B超檢查無法確定胚胎發(fā)育情況，往往需連續(xù)觀察數(shù)周。而血清hCG半衰期長，濃度變異范圍較大，正常早期妊娠與稽留流產(chǎn)之間交叉部分較大，且單次測定可能存在誤差，因此僅憑測定hCG也不足以診斷。故能否找到一些更有價值的指標(biāo)來監(jiān)測胚胎停育，為胚胎發(fā)育不良的早期發(fā)現(xiàn)、診斷和治療提供幫助，成為眾多學(xué)者廣泛研究的問題。目前已有報道，某些細(xì)胞因子對自然流產(chǎn)、早產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局有一定的預(yù)測作用［17，18］，但國內(nèi)外關(guān)于此方面的研究頗少。如前所述，母胎界面MCP－1是絨毛和蛻膜組織共同分泌的，是妊娠早期成功種植胚胎和胎盤形成過程中重要的決定因素，與自然流產(chǎn)的發(fā)生密切相關(guān)。但直接進(jìn)行絨毛和蛻膜活檢檢測MCP－1表達(dá)是侵入性方法，可能引起流產(chǎn)和胚胎損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，UERSA組血清中MCP－1蛋白的含量高于正常早孕組，且血清中MCP－1含量與母胎界面MCP－1 mRNA表達(dá)水平有良好的相關(guān)性，提示可以通過檢測孕母血清MCP－1的水平來反應(yīng)母胎界面MCP－1 mRNA的表達(dá)水平。通過監(jiān)測孕母血清MCP－1的水平評價胚胎發(fā)育情況，作為鑒別正常早期宮內(nèi)妊娠和胚胎發(fā)育不良的診斷依據(jù)，對于早期診斷胚胎停育具有重要意義。

總之，通過上述研究提示母胎界面絨毛、蛻膜組織MCP－1高表達(dá)，可能導(dǎo)致蛻膜巨噬細(xì)胞數(shù)量和活性改變而直接影響母胎間的免疫平衡，最終導(dǎo)致UERSA的發(fā)生。這一結(jié)果將有利于深入探討改變母胎界面MCP－1表達(dá)在UERSA治療中的可行性。

1 林其德，汪希鵬.原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因病理生理機(jī)制與治療臨床進(jìn)展［J］.中國實用婦科與產(chǎn)科雜志，2007，23(1):5－8.

2 Meter RA，Wira CR，F(xiàn)ahey JV，et al.Secretion of monocyte chemotactic protein－1 by human uterine epithelium directs monocyte migration in culture［J］.Fertil Steril，2005，84(1):191 － 201.

3 馬方，杜美蓉，李大金.早孕期人絨毛趨化因子CCL2及其受體CCR2的表達(dá)［J］.生殖與避孕，2009，29(11):755－758.

4 林其德.復(fù)發(fā)性流產(chǎn)免疫學(xué)診斷和治療共識［J］.生殖醫(yī)學(xué)雜志，2008，17(1):4 －5.

5 Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real－time quantitative PCR and the 2(－Delta Delta C(T))Method［J］.Methods，2001，25(4):402 －408.

6 王瓊，周燦權(quán).胚胎種植與免疫［J］.中國實用婦科與產(chǎn)科，2007，23(12):898－900.

7 Bonecchi R，Galliera E，Borroni EM，et al.Chemokines and chemokine receptors:an overview［J］.Front Biosci，2009，14:540 －551.

8 Red－Horse K，Drake PM，F(xiàn)isher SJ.Human pregnancy:the role of chemokine networks at the fetal－ maternal interface［J］.Expert Rev Mol Med，2004，6(11):1 －14.

9 Renaud SJ，Graham CH.The role of macrophages in utero－placental interactions during normal and pathological pregnancy［J］.Immunol Invest，2008，37(5):535 －564.

10 金妍，林其德，汪希鵬，等.原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者巨噬細(xì)胞表面TSP1、CD36、CD47的表達(dá)及其細(xì)胞因子的分泌.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2006，15(2):926 －929.

11 Yu XW，Yan CF，Jin H，et al.Tumor ncrosis factor receptor 1 expression and early spontaneous abortion［J］.Int J Gynecol Obstet，2005，88(1):44 －48.

12 Mor G，Abrahams VM.Potential role of macrophages as immunnoregulators of pregnancy［J］.Reprod Biol Endocrinol，2003，1:119.

13 Fest S，Aldo PB，Abrahams VM，et al.Trophoblast－macrophage interactions:a regulatory network for the protection of pregnancy［J］.Am J Reprod Immunol，2007，57(1):55 －66.

14 Lockwood CJ，Matta P，Krikun G，et al.Regulation of monocyte chemoattractant protein－1 expression by tumor necrosis factor－alpha and interleukin－1 beta in first trimester human decidual cells:implicationsfor preeclampsia［J］.Am J Pathol，2006，168(2):445 －452.

15 米亞英，楊俊英.自然流產(chǎn)小鼠蛻膜組織腫瘤壞死因子－α和單核細(xì)胞趨化蛋白－1的表達(dá)［J］.中國計劃生育學(xué)雜志，2007，15(7):411－413.

16 Chaiworapongsa T，Romew R，Tolosa JE，et a1.Elevated monocyte chemotactic protein－1 in amniotic fluid is a risk factor for pregnancy loss［J］.J Matern Fetal Neonatal Med，2002，12(3):159 －164.

17 Whitcomb BW，Schisterman EF，Klebanoff MA，et al.Circulating Chemokine Levels and Miscarriage［J］.Am J Epidemiol，2007，166(3):323－331.

18 van Mourik MS，Macklon NS，Heijnen CJ.Embryonic implantation:cytokines，adhesion molecules，and immune cells in establishing an implantation environment［J］.J Leukoc Biol，2009，85(1):4 －19.