酶酸結(jié)合法降解植物纖維素新工藝

趙永亮，侯啟昌，楊霞，王衛(wèi)國，崔羽佳，李鵬，郭家瑞，張鵬，丁金聚

(1.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州，450001；2.河南廣播電視大學(xué) 農(nóng)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州，450008；3．河南職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品系，河南 鄭州，450004)

纖維素是地球上最豐富的資源。僅在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，我國每年形成的秸桿就有8億t左右；在工業(yè)生產(chǎn)中，還有數(shù)百萬噸纖維素廢棄物。這些纖維素資源既沒有得到充分利用，又污染環(huán)境。纖維素降解后得到的葡萄糖可作為釀造、制藥、飼料等許多產(chǎn)業(yè)部門的原料，可替代這些行業(yè)每年消耗掉的數(shù)千萬噸糧食。據(jù)報(bào)道，全世界46億人中有6億人處于饑餓狀態(tài)，因此，進(jìn)行植物纖維降解研究，把其轉(zhuǎn)化成可供微生物、動(dòng)物和人直接利用的原料或制造生物能源的原料，不僅可以緩解和解決“人與工業(yè)爭(zhēng)糧”、“人與牲畜爭(zhēng)糧”、能源危機(jī)的根本矛盾，而且對(duì)于我們這個(gè)可耕地日益減少、人口日益增多的大國來說，更具有重要的戰(zhàn)略意義。雖然國內(nèi)外對(duì)降解植物纖維的研究較多[1?4]，但大多從微生物[5?8]或酶[9?11]的角度進(jìn)行。由于酶的分解代謝物或終產(chǎn)物的抑制性、酶的不穩(wěn)定性使得這類方法難以推廣，已報(bào)道的其他方法如美國專利[12]也因條件苛刻(160～230 ℃)、成本高而難以應(yīng)用，酶酸結(jié)合法降解植物纖維素的文獻(xiàn)報(bào)道甚少。文獻(xiàn)[13]比較了在酸或酶的作用下纖維素的部分(不完全)降解特性。文獻(xiàn)[14]則探討了以甘蔗渣為材料用醋酸預(yù)處理后酶的降解效果。文獻(xiàn)[13?14]也均未對(duì)酶酸循環(huán)利用降解纖維素進(jìn)行進(jìn)一步研究。在此，本文作者通過反復(fù)試驗(yàn)與探索，找到了一種條件溫和、工藝簡(jiǎn)單、成本低、周期短的降解植物纖維素工藝(纖維素酶酸循環(huán)降解法(CDCA法))，可為發(fā)酵工業(yè)上以纖維素為原料從事乙醇、抗生素、SCP(Single cell protein)等產(chǎn)品的開發(fā)生產(chǎn)及環(huán)保上固態(tài)生活垃圾的生物處理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 材料

材料為：麥秸，乙酸(AR)，冰乙酸(AR)，鹽酸(AR)，硫酸(AR)，硝酸(AR)，NaOH(AR)，Na2S(AR)，羧甲基纖維素，醋酸鈉(AR)，纖維素酶，乙醇(AR)等。

1.2 方法

1.2.1 原料的預(yù)處理

根據(jù)工藝要求秤取一定量的干麥秸粒度粉碎至小米粒般大小。將粉碎后的原料用 8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)NaOH+Na2S煮沸1 h，以除去部分木質(zhì)素和半纖維素。麥秸原料中纖維素含量為 44.9%，預(yù)處理后的材料中的水分含量為10.6%，纖維素含量為66.8%。

采用烘干失重法[15]測(cè)定原料中的水分含量；采用硝酸?乙醇法[16]測(cè)定纖維素的含量。

1.2.2 纖維素酶活力的測(cè)定

采用CMC液化力法[17]并略作改進(jìn)。取2.5 mL適當(dāng)稀釋的酶液，加2.5 mL 0.2 mol/L醋酸緩沖液(pH為5.0)和5 mL 1% CMC溶液，于30 ℃反應(yīng)10 min。用奧氏黏度計(jì)法[18]測(cè)定反應(yīng)前后樣液的比黏度，按下式計(jì)算CMC酶活力：

其中：A為CMC酶活力；v1為反應(yīng)前比黏度；v2為反應(yīng)后比黏度；t為反應(yīng)時(shí)間。

1.2.3 還原糖含量的測(cè)定

采用斐林氏氧化?還原定糖法[19]測(cè)定還原糖含量。按下式計(jì)算纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的轉(zhuǎn)化率η：

其中：η為纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的轉(zhuǎn)化率；m1為葡萄糖質(zhì)量；m2為原始纖維素總質(zhì)量。

1.2.4 酶酸結(jié)合法降解植物纖維素的試驗(yàn)方案

軟文化包括適合學(xué)生的電影、電視、書刊雜志、網(wǎng)絡(luò)信息等豐富的教學(xué)資源，給學(xué)生提供貼近學(xué)生實(shí)際、貼近生活、貼近時(shí)代的內(nèi)容和豐富的課堂內(nèi)容。這些軟文化能夠拓展學(xué)習(xí)和運(yùn)用英語的渠道，使得知識(shí)融會(huì)貫通。

以混酸法[20]及短時(shí)單酶法[21]降解植物纖維素的最佳結(jié)果為基礎(chǔ)，并考慮酸、酶添加順序的影響，設(shè)計(jì)了酶酸結(jié)合法降解植物纖維素的2個(gè)試驗(yàn)方案。方案1：先酸解后酶解；方案2：先酶解后酸解。具體試驗(yàn)方案見表1、表2和圖1。在考慮多因素影響的前提下，以上述2個(gè)試驗(yàn)方案的最佳結(jié)果為基礎(chǔ)，又進(jìn)一步設(shè)計(jì)出一種酶酸循環(huán)降解法(CDCA法)。取 500 g預(yù)處理的麥秸按序依次置于 5 L反應(yīng)器中，先添加0.2%的纖維素酶和1 L水，于50 ℃反應(yīng)2 h 以備后用。其他所需反應(yīng)劑按表3中的要求添加至反應(yīng)器中。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理方法

所有試驗(yàn)結(jié)果均取3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值。采用方差分析法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用F值檢驗(yàn)判斷組間差異有無顯著性[22]。

2 結(jié)果與討論

2.1 先酸解后酶解在纖維素糖化中的作用

先酸解后酶解的具體試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)出2套，其詳細(xì)的降解條件、試驗(yàn)程序及纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的轉(zhuǎn)化率見表1。

從表1可以看出：當(dāng)依次加入 CH3COOH，HCl和纖維素酶時(shí)，纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的轉(zhuǎn)化率(R)為69.5% (F＞F0.01，p＜0.01，這表示該結(jié)果經(jīng)過方差分析，具有極顯著性，其置信度達(dá)99%)，降解終產(chǎn)物中葡萄糖的最高含量達(dá)1.28% (F＞F0.01，p＜0.01)；而當(dāng)CH3COOH和HCl同時(shí)加入、再加入纖維素酶時(shí)，纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的轉(zhuǎn)化率(R)則為65.4% (F＞F0.01，p＜0.01)，降解終產(chǎn)物中葡萄糖的最高含量為1.15% (F＞F0.01,p＜0.01，這表示該結(jié)果經(jīng)過方差分析，具有極顯著性，其置信度達(dá)99%)。葡萄糖的轉(zhuǎn)化率和終糖含量均降低。

表1 先酸解后酶解的具體試驗(yàn)方案及纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的轉(zhuǎn)化率Table1 Experimental procedures and transformation rate of cellulose to glucose by enzyme-lyses after acids-lyses

從表1還可以看出：不管酸是依次加入還是同時(shí)加入，隨著酶反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的轉(zhuǎn)化率(R)呈下降趨勢(shì)。多次實(shí)踐證明：酸反應(yīng)后的溶液不太適合酶反應(yīng)的進(jìn)行，而且酶反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，其副作用也越大。

2.2 先酶解后酸解在纖維素糖化中的作用

先酶解后酸解的具體試驗(yàn)方案也設(shè)計(jì)出2套，其詳細(xì)的降解條件、試驗(yàn)程序及纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的轉(zhuǎn)化率見表2。

表2 先酶解后酸解的具體試驗(yàn)方案及纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的轉(zhuǎn)化率Table2 Experimental procedures and transformation rate of cellulose to glucose by enzyme-lyses followed by acids-lyses

從表1和表2還可以看出：先酶解后酸解試驗(yàn)方案優(yōu)于先酸解后酶解試驗(yàn)方案；在CH3COOH和HCl依次和同時(shí)加入反應(yīng)體系的條件下，先酶解后酸解試驗(yàn)方案的轉(zhuǎn)化率R分別比先酸解后酶解試驗(yàn)方案的R提高 29.0%和 16.1%。其原因可能是：當(dāng)纖維素酶首次投入應(yīng)用時(shí)，酶反應(yīng)的最佳條件容易實(shí)現(xiàn)；纖維素酶能裂解纖維素晶體，以利于纖維素分子易于接觸水和酸，進(jìn)而把纖維素分子分解為大量的纖維二糖和纖維三糖；纖維二糖和纖維三糖在酸性條件下，很容易被降解成葡萄糖，使纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的轉(zhuǎn)化率(R)大幅度提高。如果采用先酸解后酶解試驗(yàn)方案，雖然第1步酸解后，R即可達(dá)60%左右，但由于反應(yīng)產(chǎn)生的大量副產(chǎn)物影響了酶活性的發(fā)揮，所以，R的增加量不大。副產(chǎn)物的存在不僅會(huì)影響酶活性的發(fā)揮，而且隨著副產(chǎn)物的大量增多，R趨于下降。R降低的原因可能是：在酸作用下，葡萄糖降解產(chǎn)生了其他副產(chǎn)物。

2.3 纖維素酶酸循環(huán)降解(CDCA)方案及工藝流程

雖然先酶解后酸解試驗(yàn)方案工藝能使纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的轉(zhuǎn)化率高達(dá)91.7% (F＞F0.01，p＜0.01)，但是，因?yàn)辂溄赵戏浅Ｅ钏桑w積大，單次降解的底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多只能達(dá)5%左右，這樣，使得終產(chǎn)物葡萄糖的含量太低而難以應(yīng)用。為此，本研究設(shè)計(jì)出一種纖維素酶酸循環(huán)降解(CDCA)方案，其工藝流程見圖1。

從圖1可以看出：纖維素酶酸循環(huán)降解(CDCA)方案系統(tǒng)非常簡(jiǎn)單，它僅由1個(gè)總反應(yīng)器、1個(gè)副反應(yīng)器、3個(gè)酶反應(yīng)器和3個(gè)酸儲(chǔ)罐組成。整個(gè)工藝流程僅需5套裝備、3套反應(yīng)器和2套儲(chǔ)罐。

2.4 纖維素酶酸循環(huán)降解工藝(CDCA)的操作程序、轉(zhuǎn)化率及終糖含量

纖維素酶酸循環(huán)降解工藝(CDCA)的操作程序、反應(yīng)條件、纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的轉(zhuǎn)化率、反應(yīng)每步降解物中葡萄糖的含量及降解終產(chǎn)物中葡萄糖的含量見表3。

由表3及圖1可以看出：酶酸結(jié)合的纖維素連續(xù)循環(huán)降解法不僅步驟少，耗時(shí)短，而且具有較高的轉(zhuǎn)化率和終糖含量，可使纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的轉(zhuǎn)化率R達(dá)98.68%(F＞F0.01，p＜0.01)，終產(chǎn)品中葡萄糖的終糖含量達(dá)5.38% (F＞F0.01，p＜0.01)。表3中最后2列數(shù)據(jù)顯示：當(dāng)纖維素轉(zhuǎn)化率為 89.8%時(shí)，葡萄糖含量為2.85%；當(dāng)纖維素轉(zhuǎn)化率為98.68%時(shí)，葡萄糖含量即可達(dá)到5.38%，纖維素轉(zhuǎn)化率增幅不到10%，葡萄糖含量增幅卻可達(dá)到89%。其原因主要是本研究采用了纖維素連續(xù)循環(huán)降解方案，該方案能大幅度提高底物纖維素的添加量或消耗量。從理論上說，纖維素轉(zhuǎn)化率為 98.68%時(shí)已接近高限理論值，要再提高很困難，而產(chǎn)物葡萄糖的含量則會(huì)隨著底物消耗量的明顯增大而快速提高。多數(shù)工業(yè)發(fā)酵產(chǎn)品生產(chǎn)的培養(yǎng)基中僅需 3%左右的葡萄糖，因此，本研究的終產(chǎn)物經(jīng)適當(dāng)調(diào)節(jié) pH和復(fù)合配制即可直接用做乙醇、抗生素、單細(xì)胞蛋白等發(fā)酵法生產(chǎn)的原料。本降解方法亦可用于生活垃圾等固態(tài)廢棄物的生物處理。

圖1 纖維素酶酸循環(huán)降解(CDCA)方案及工藝流程Fig.1 Schematic flow diagram of CDCA for production of glucose with cellulose

表3 CDCA的操作程序、反應(yīng)條件、纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的轉(zhuǎn)化率及糖含量Table3 Operating procedures and reaction conditions, transformation ratio of glucose from cellulose and percentage of glucose by CDCA

酶酸結(jié)合的纖維素連續(xù)循環(huán)降解法的操作條件相當(dāng)溫和。其反應(yīng)溫度不超過100 ℃，所需壓力低于100 kPa，而文獻(xiàn)[12]中需要高溫高壓。與傳統(tǒng)的纖維素酶解需24 h以上相比，該方法的全生產(chǎn)周期可縮短至15 h之內(nèi)。酶酸結(jié)合的纖維素連續(xù)循環(huán)降解法的工藝過程也比較短，整個(gè)過程僅需操作9步，整個(gè)系統(tǒng)所需反應(yīng)器不超過7套。

酶酸結(jié)合的纖維素連續(xù)循環(huán)降解法能使終降解物中葡萄糖的終含量達(dá)5.38% (F＞F0.01，p＜0.01)。雖然本研究方案2在7 h內(nèi)能使R達(dá)91.7% (F＞F0.01，p＜0.01)，但終糖含量只有 2.93% (F＞F0.01，p＜0.01)。與文獻(xiàn)[1, 2, 7, 8]的報(bào)道相比，采用CDCA法所得的終糖含量幾乎是它們的3倍。所以，采用CDCA法非常有利于提高終糖含量，在此工藝條件下，能使纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的轉(zhuǎn)化率R達(dá)98.68%。轉(zhuǎn)化率R和終糖含量這 2個(gè)參數(shù)在提高原料利用率方面是至關(guān)重要的。因此，為了更有效地利用原料，如何使轉(zhuǎn)化率和終糖含量進(jìn)一步提高有待深入研究。

生產(chǎn)成本對(duì)于一個(gè)技術(shù)方法能否投入實(shí)用也是必需考慮的關(guān)鍵問題。酶酸結(jié)合的纖維素循環(huán)降解法不僅能使纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的轉(zhuǎn)化率和終糖含量明顯提高，它還可以大幅度降低酸的用量，并改善下游工藝。與常規(guī)技術(shù)相比，該新工藝只需25%的醋酸、50%的鹽酸和少量酶，可以大幅度地降低纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖的成本。同時(shí)，由于該工藝采用酸的分步間斷添加且用量較少，使得酶和酸的循環(huán)利用成為可能。

本文作者采用CDCA法對(duì)麥秸進(jìn)行了研究，其是否適用于其他材料還需進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

(1)獲得一種降解植物纖維素的新型工藝方法，即酶酸結(jié)合纖維素循環(huán)降解法(CDCA法)。該工藝方法具有條件溫和、過程簡(jiǎn)單、成本低和周期短等特點(diǎn)。

(2)采用先酶解后酸解方案，7 h內(nèi)在纖維素酶、CH3COOH 和 HCl依次添加的條件下能使纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)91.7% (F＞F0.01，p＜0.01)。

(3)酶酸結(jié)合纖維素循環(huán)降解法(CDCA 法)不僅步驟少，耗時(shí)短，而且具有較高的轉(zhuǎn)化率和終糖含量。在反應(yīng)溫度不超過 100℃、壓力為 100 kPa、時(shí)間為15 h之內(nèi)，可使纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)98.68%(F＞F0.01，p＜0.01)，終產(chǎn)品中葡萄糖的終糖含量達(dá)5.38%(F＞F0.01，p＜0.01)。與常規(guī)技術(shù)相比，該新工藝只需25%的醋酸、50%的鹽酸和少量酶，可以大幅度地降低纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖的成本，是一種值得進(jìn)一步開發(fā)和推廣的方法。

(4)先酶解后酸解工藝優(yōu)于先酸解后酶解工藝；CDCA工藝又明顯優(yōu)于先酶解后酸解工藝。酶酸結(jié)合纖維素循環(huán)降解工藝方法(CDCA法)具有條件溫和、工藝簡(jiǎn)單、成本低和周期短等特點(diǎn)，該工藝方法可為發(fā)酵工業(yè)上以纖維素為原料從事乙醇、抗生素、SCP等產(chǎn)品的開發(fā)生產(chǎn)及環(huán)保上固態(tài)生活垃圾的生物處理提供科學(xué)依據(jù)。

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