鵝不食草植物蛋白的純化與含量測定

符玉榮

（吉林省長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，吉林 長春 130021）

鵝不食草（Centipeda minima（L）A.Br.et Aschers）為菊科植物鵝不食草的干燥全草。據(jù)《本草綱目》記載有通竅，止咳之功。主治風(fēng)寒感冒，咳嗽痰多，鼻塞不通，鼻淵流涕等。主要含有甾醇類、黃酮類、三萜皂苷、揮發(fā)油、胺類等成分。迄今為止，針對其蛋白類成分的研究還未見相關(guān)報道。蛋白質(zhì)作為一類重要的大分子化合物，廣泛存在于動物和植物的組織細(xì)胞中，是生命存在的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。目前多集中于對動物蛋白的研究，對植物蛋白的研究相對較少，但研究發(fā)現(xiàn)許多植物蛋白具有較好的藥理活性[1,2]，因此植物中蛋白質(zhì)的相關(guān)研究應(yīng)該引起廣泛重視。本課題以鵝不食草為原料，對其蛋白類成分進(jìn)行系統(tǒng)研究，為深入了解鵝不食草這一藥用植物資源奠定基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 儀器

UV-1700型分光光度計（日本島津）；5424離心機（德國eppendorf）；PHS-4CT酸度計（上海緊密儀器儀表有限公司）；EPS-200電泳儀（上海天能科技有限公司）；Bench-top凍干機（美國Millrock）；MDCC-14透析袋（上海基峰）。

表1 SP柱層析各洗脫成分總蛋白的含量

1.2 試藥

鵝不食草（采于吉林長白縣）；低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白（上?；?，批號674501351）；牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（上?；?，批號796502312）；其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 硫酸銨沉降法提取鵝不食草粗蛋白

取鵝不食草粉末適量，用8倍量Tris-HCl（25mmol/L，pH值7.0）超聲提取2h，過濾，藥渣加6倍量Tris-HCl（25mmol/L，pH值7.0）超聲提取1h，過濾，合并兩次濾液，濾液中加固體硫酸銨至飽和度80%，靜止后于-20℃條件下加入80%丙酮，離心后取沉淀，-20℃揮凈丙酮，Tris-HCl（25mmol/L，pH值7.0）溶解沉淀，過濾后所得續(xù)濾液即為粗蛋白提取液。

2.2 鵝不食草粗蛋白提取物的純化

2.2.1 樣品透析

將粗蛋白提取液在4℃條件下用Tris-HCl緩沖溶液（25mmol/L，pH值7.0）透析24h（每間隔12h更換一次緩沖溶液），得透析液。

2.2.2 樣品脫色

取透析液，加入活性炭（10mL：0.3g）攪拌脫色10min，靜止、過濾，濾液凍干后得脫掉植物色素的蛋白粗提物。

2.2.3 樣品純化

取粗蛋白凍干品少量，Tris-HCl（50mmol/L，pH值7.0）溶解后上G100，根據(jù)紫外檢測器（檢測波長280nm）檢測結(jié)果富集流出液，流出液上DEAE Sepharose（柱高2cm，柱床體積為5mL），DEAE Sepharose流穿上SP Sepharose（柱高2cm，柱床體積為5mL），SP Sepharose層析柱用0.5mol/L NaCl（NaCl用25mmol/L、pH值為6.0的Tris-HCl緩沖溶液溶解）溶液洗脫，流速0.5mL/min，檢測器波長280nm，按管收集，所得洗脫液用Tris-HCl緩沖溶液（25mmol/L，pH值7.0）透析24h，透析液凍干，即得鵝不食草純化蛋白。

2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的制備

2.3.1 緩沖液的制備

取Tris0.3g，甘油2.5mL，β-巰基乙醇2.5mL，溴酚藍(lán)0.025g，SDS0.5g，溶于25mL蒸餾水中，HCl調(diào)pH至7.0即得。

2.3.2 蛋白質(zhì)樣品的制備

取純化蛋白凍干樣品，溶于2.3.1項下制得的緩沖液中，使?jié)舛葹?mg/mL，取20μL溶液沸水浴中加熱5min，冷卻離心后即得。

2.3.3 低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的制備

取低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，溶于2.3.1項下制得的緩沖液中，使?jié)舛葹?mg/mL，取20μL溶液沸水浴中加熱5min，冷卻后即得。

2.3.4 SDS-聚丙烯酰胺凝膠按Laemmli法[3]進(jìn)行，凝膠濃度為15%。蛋白鑒定結(jié)果，如圖1。

2.4 Lowry法測蛋白含量[4]

2.4.1 蛋白樣品的制備

精確稱取SP Sepharose純化蛋白凍干樣0.1g， 置100mL容量瓶中，用蒸餾水溶解并定容至刻度，作為供試品溶液。

2.4.2 白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

圖1 鵝不食草蛋白SP柱層析各洗脫成分電泳圖

精確稱取牛血清白蛋白30mg， 置100mL容量瓶中，用蒸餾水溶解并定容至刻度，作為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

2.4.3 顯色劑的制備

配置4%碳酸鈉50mL，2%氫氧化鈉50mL，1%硫酸銅10mL，2%酒石酸鉀鈉10mL。將以上四種溶液混勻得試劑甲。Folin--酚試劑為試劑乙。

2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精確量取白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（304μg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10mL容量瓶中，定容至1mL，加試劑甲5mL，混勻，室溫放置10min，快速加入試劑乙0.5mL，混勻，室溫放置1h，以第1管為空白，采用分光光度法于500nm處測定其吸光度。以蛋白質(zhì)含量（m）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析，得出回歸方程為：A=0.0016m+0.023，r=0.9992。結(jié)果表明溶液濃度在60.8～304μg/mL范圍內(nèi)，吸光度與濃度呈良好線性關(guān)系。

2.4.5 蛋白含量的測定

量取上述蛋白樣品溶液1mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制項下方法進(jìn)行含量測定，自“加試劑甲5mL”起, 依法測定其吸光度，用直線回歸法計算蛋白含量。蛋白含量，見下表1。

3 討 論

鵝不食草蛋白是典型的植物蛋白，植物色素含量多，成分復(fù)雜，在原植物中的含量少。但本實驗通過提取、分離、純化等過程，大大提高了其純度，使最終蛋白含量達(dá)到85%以上，并有效脫掉其所含植物色素。值得一提的是，本實驗用活性炭脫鵝不食草中的植物色素效果明顯，且不吸附蛋白，用量少，節(jié)省時間，相對PVP法、C18法大大節(jié)省成本。

在純化過程中發(fā)現(xiàn)，鵝不食草蛋白經(jīng)過DEAE Sepharose層析柱后大量蛋白沒有被吸附，而是存在于流穿當(dāng)中，流穿經(jīng)過SP Sepharose后明顯被吸附，說明鵝不食草植物蛋白中堿性蛋白居多。

通過凝膠電泳結(jié)果顯示，鵝不食草蛋白相對分子質(zhì)量在18 100與92 000區(qū)間，約有5種主要蛋白帶，且電泳條帶較窄，數(shù)目多，清晰，且在20 100、43 000、66 200KD處有三條主蛋白帶。電泳結(jié)果進(jìn)一步驗證提取純化方法的有效性。為進(jìn)一步分離純化鵝不食草植物蛋白奠定基礎(chǔ)。

Lowry法是生物化學(xué)領(lǐng)域測定微量蛋白質(zhì)用得最多的方法，其精密度好，對多個樣品同時測定較為方便。故本實驗采用Lowry法測定鵝不食草植物蛋白安全可靠。

[1]中國生物制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會編.中國生物制品規(guī)程[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000,671-672.

[2]李曉波,金鑫,李妍等.植物類中藥活性蛋白成分研究進(jìn)展[J].中草藥,2004,35(6):706-708

[3]哈密斯BD,利克伍德D. 蛋白質(zhì)的凝膠電泳方法[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1994 : 19221.

[4]史鋒.生物化學(xué)實驗.杭州:浙江大學(xué)出版社,2002.