百癬夏塔熱膠囊對(duì)小鼠接觸性皮炎的作用及機(jī)制研究

陳菲菲,朱曉芳,高 慧,駱 丹

(1.揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院皮膚科,江蘇揚(yáng)州,225001;2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科,江蘇南京,210029)

變應(yīng)性接觸性皮炎(ACD)是皮膚、黏膜接觸致敏物后,由T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)引起的炎癥性皮膚病。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子在變應(yīng)性接觸性皮炎的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用,核因子-κ B參與免疫與炎癥的調(diào)節(jié)過(guò)程。百癬夏塔熱膠囊具有清除異常黏液質(zhì)、膽液質(zhì)及敗血、消腫止癢,清熱解毒等功能,用于治療過(guò)敏性皮炎、帶狀皰疹、花斑癬、銀屑病、和痤瘡等。本研究通過(guò)建立小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎模型,觀察百癬夏塔熱膠囊對(duì)小鼠ACD的治療作用,探討百癬夏塔熱膠囊對(duì)小鼠ACD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用小鼠為揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供的昆明小鼠42只,雌雄各半,6～8周齡,體重25～30 g。小鼠飼養(yǎng)于金屬籠中,隨意飲食、飲水,周?chē)鷾囟?0℃,濕度60%。

1.2 主要試劑和試劑盒

2,4-二硝基氟苯(SigmaAldrich公司)、百癬夏塔熱膠囊(陜西東泰制藥)、地塞米松片(浙江仙琚制藥股份有限公司)、TNF-α ELISA試劑盒、NF-κ B免疫組化試劑盒(武漢博士德公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)器材與儀器

皮膚圓形打孔器(直徑6 mm)、電子分析天平、數(shù)顯游標(biāo)卡尺、微孔板酶標(biāo)儀、酶標(biāo)儀洗板機(jī)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎模型建立:①DNFB配備:250 mg DNFB加入4:1體積比的丙酮與橄欖油混合液50 mL,配成0.5%的DNFB溶液;將250 mg DNFB加入4:1體積比的丙酮與橄欖油混合液125 mL,配成0.2%的DNFB溶液。②取昆明小鼠10只,雌雄各半,小鼠于實(shí)驗(yàn)前1天在腹部備皮2 cm×1.5 cm,用8%硫化鈉水溶液脫毛,生理鹽水充分擦洗。實(shí)驗(yàn)第1天、第2天在腹部去毛部位涂布0.5%的25 μ L DNFB溶液致敏。實(shí)驗(yàn)第6天在小鼠的左耳腹、耳背面涂布0.2%的20 μ L DNFB溶液誘發(fā)皮炎。右耳涂布20 μ L基質(zhì)[1]。建立小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎模型。實(shí)驗(yàn)第7天觀察小鼠左耳大體形態(tài)變化,處死后取左耳皮損行組織病理檢查,判定造模是否成功。

百癬夏塔熱膠囊對(duì)小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎模型的影響:①實(shí)驗(yàn)分組:造模成功后,32只小鼠被隨機(jī)分為4組,分別為正常對(duì)照組、模型組、地塞米松對(duì)照組和百癬夏塔熱給藥組,每組8只。②DNFB誘發(fā)模型:同小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎模型建立。③給藥方法:百癬夏塔熱組小鼠體重用藥量為30 g左右小鼠0.1片/d(藥物劑量按每千克體質(zhì)量為《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定臨床用量的20倍),溶于0.5%羧甲基纖維素溶液中,將藥物濃度校正到實(shí)驗(yàn)中每30g小鼠體質(zhì)量灌胃量為0.4 mL。地塞米松體重用藥量為30 g左右小鼠0.09 mg/d(按成人每天地塞米松9 mg,小鼠用藥量為20倍),溶于0.5%羧甲基纖維素溶液中,每次取0.4 mL灌胃。模型組每次予以生理鹽水0.4 mL灌胃。實(shí)驗(yàn)第1天起各組自第1次涂藥前2 h灌胃,連續(xù)用藥5 d,1次/d。實(shí)驗(yàn)第6天涂藥前2 h及涂藥后6 h灌胃各1次。所有小鼠于第7天摘眼球取血備用。測(cè)量小鼠雙耳中部厚度,用皮膚圓形打孔器沿小鼠左耳耳緣中部打孔,所取左耳組織置于95%酒精中固定。進(jìn)行組織病理檢查及免疫病理檢查。

觀察指標(biāo):①耳厚度差:數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠雙側(cè)耳中部的厚度,計(jì)算誘發(fā)后左右耳厚度差。②組織病理檢查:處死后取小鼠左耳組織常規(guī)石蠟切片,HE染色。光鏡觀察組織病理變化。③NF-κ B在皮損處的表達(dá):小鼠左耳組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)切片,切片常規(guī)脫蠟至水,3%H2O2溶液消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性,熱修復(fù)抗原,滴加5%BSA封閉液,然后依次加入一抗、生物素化二抗,SABC后,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,脫水,透明,封片。顯微鏡觀察。④血清TNF-α檢測(cè)小鼠摘除眼球取血1.5 mL,靜置15 min后,3 000 r/min離心15 min,分離血清,采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清中細(xì)胞因子TNF-α水平。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎模型的建立

用DNFB誘發(fā)的小鼠左耳腫脹、充血,耳部血管擴(kuò)張。組織病理顯示表皮角化過(guò)度,表皮增厚,表皮細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)水腫,能發(fā)現(xiàn)較多的單一核細(xì)胞及少數(shù)多形核細(xì)胞的浸潤(rùn)。真皮結(jié)締組織水腫,血管周?chē)梢?jiàn)輕度細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)圖1)。小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎模型成功建立。

2.2 各藥物對(duì)鼠耳厚度的影響

肉眼觀察,模型組小鼠左耳腫脹、充血,可見(jiàn)耳部血管擴(kuò)張。地塞米松對(duì)照組及百癬夏塔熱給藥組小鼠左耳腫脹不明顯,無(wú)明顯充血。地塞米松組及百癬夏塔熱組誘發(fā)后小鼠左右耳厚度差與模型組相比明顯減小。地塞米松及百癬夏塔熱膠囊能有效改善變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠耳腫脹情況,見(jiàn)表 1。

圖1 小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎臨床、組織病理改變(HE染色 100倍)

表1 百癬夏塔熱膠囊對(duì)接觸性皮炎小鼠耳厚度差的影響( x±s)

圖2 各藥物對(duì)組織病理的影響(HE染色 100倍)

2.3 各藥物對(duì)組織病理學(xué)的影響

模型組HE染色切片可見(jiàn):表皮角化過(guò)度,表皮增厚,表皮細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)水腫,能發(fā)現(xiàn)較多的單一核細(xì)胞及少數(shù)多形核細(xì)胞的浸潤(rùn)。真皮結(jié)締組織水腫,血管周?chē)梢?jiàn)輕度細(xì)胞浸潤(rùn)。地塞米松對(duì)照組及百癬夏塔熱給藥組HE染色切片可見(jiàn):表皮、真皮無(wú)明顯水腫,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少(見(jiàn)圖2)。

2.4 各藥物對(duì)NF-κ B檢測(cè)結(jié)果的影響

NF-κ B p65在變應(yīng)性接觸性皮炎皮損角質(zhì)形成細(xì)胞核周和胞漿表達(dá),模型組皮損處胞漿及部分胞核可見(jiàn)棕黃色顆粒沉著。百癬夏塔熱組及地塞米松組NF-κ B p65表達(dá)明顯減少甚至消失,正常對(duì)照組未見(jiàn)NF-κ B p65表達(dá)(見(jiàn)圖 3)。

圖3 各藥物對(duì)耳組織NF-κ B表達(dá)的影響(SP染色 200倍)

2.5 各藥物對(duì)小鼠血清中細(xì)胞因子TNF-α的影響

模型組小鼠血清中TNF-α水平比正常對(duì)照組明顯升高,經(jīng)百癬夏塔熱膠囊及地塞米松處理后的小鼠血清TNF-α水平與模型組相比明顯下降,百癬夏塔熱膠囊及地塞米松能降低變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠血清中TNF-α含量,抑制了變應(yīng)性接觸性皮炎的炎癥反應(yīng),見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠血清中TNF-α數(shù)值測(cè)定( x±s)

實(shí)驗(yàn)前各組小鼠體重?zé)o明顯差異,各組給藥過(guò)程中體重略有下降,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明百癬夏塔熱膠囊對(duì)小鼠生理及代謝功能無(wú)明顯影響,各組動(dòng)物一般狀況良好。

3 討 論

變應(yīng)性接觸性皮炎屬于與Ⅳ型變態(tài)反應(yīng),皮疹多形性、劇烈瘙癢、易于復(fù)發(fā)。目前大多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為,變應(yīng)性接觸性皮炎主要由 Th1型細(xì)胞介導(dǎo),而Th2型細(xì)胞參與其調(diào)節(jié)過(guò)程。

TNF-α主要由Th1細(xì)胞分泌,它在ACD的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2],TNF-α是重要的炎癥前介質(zhì),可以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生、黏附分子(如ICAM-1)和協(xié)同刺激因子的表達(dá)[3-4],也具有局部促炎性反應(yīng)作用,改變血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性,增加血管滲出,刺激中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞的趨化反應(yīng),從而啟動(dòng)炎性反應(yīng),加強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能,誘導(dǎo)前列腺素的合成等。同時(shí)促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng),刺激IL-1、IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)等其他細(xì)胞因子合成釋放,產(chǎn)生細(xì)胞因子的瀑布效應(yīng)。在變應(yīng)性接觸性皮炎發(fā)病過(guò)程中能夠最終導(dǎo)致白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞等外滲至組織內(nèi)引起炎癥反應(yīng)。同時(shí),腫瘤壞死因子TNF-α對(duì)朗格漢斯細(xì)胞的活化、移動(dòng)和抗原的提呈起重要作用[5]。

NF-κ B在變應(yīng)性接觸性皮炎發(fā)病過(guò)程中起著重要的作用,首先NF-κ B在抗原遞呈細(xì)胞成熟階段與分化中起重要的作用,它是樹(shù)突狀細(xì)胞成熟過(guò)程中炎癥刺激信號(hào)的轉(zhuǎn)換器,與樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟密切相關(guān)[6],促進(jìn)了變應(yīng)性接觸性皮炎發(fā)病初始階段抗原遞呈作用。其次NF-κ B可能作為始發(fā)炎癥反應(yīng)的上游環(huán)節(jié)在疾病中起重要作用?；罨腘F-κ B參與機(jī)體多種蛋白、酶及細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄[7],激活的NF-κ B可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的多種炎癥相關(guān)基因表達(dá)[8]、炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1 、IL-6)、趨化因子、協(xié)同刺激分子及黏附分子等表達(dá),進(jìn)而參與免疫炎癥反應(yīng)調(diào)控。因此NF-κ B的激活就可作為炎性反應(yīng)的觸發(fā)器及關(guān)鍵環(huán)節(jié),瀑布式誘導(dǎo)機(jī)體一系列炎性反應(yīng)因子的產(chǎn)生[9],最終導(dǎo)致炎性病理?yè)p傷。

腫瘤壞死因子(TNF-α)是誘導(dǎo)NF-κ B活化的重要細(xì)胞因子。TNF-α能夠調(diào)節(jié)皮膚炎癥相關(guān)分子的表達(dá)而激發(fā)皮膚炎癥。已有多項(xiàng)研究結(jié)果支持NF-κ B與TNF-α之間可形成相互激活的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。TNF-α正反饋調(diào)節(jié)NF-κ B激活后,可增強(qiáng)TNF-α和IL-1β等的基因轉(zhuǎn)錄,促使TNF-α和IL-1β產(chǎn)生和釋放增多,后者又導(dǎo)致NF-κ B的進(jìn)一步激活。

百癬夏塔熱膠囊是由蘆薈、地錦草、司卡摩尼亞脂、毛訶子肉、訶子肉、西青果等藥加工而成的維藥制劑,能穩(wěn)定肥大細(xì)胞的細(xì)胞膜,抑制肥大細(xì)胞脫顆粒,提高致癢閥[10]?，F(xiàn)代藥理研究證明,蘆薈和訶子具有抗炎、止癢、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等藥理作用[11],訶子肉,毛訶子肉、西青果的主要有效成分均為沒(méi)食子酸[12]。沒(méi)食子酸具有抗炎、抗突變、抗氧化等多種生物學(xué)活性。

百癬夏塔熱膠囊臨床上可以用于過(guò)敏性皮炎等疾病的治療,但治療的機(jī)理少有人研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示,通過(guò)小鼠耳腫脹度及組織病理的變化,證明百癬夏塔熱膠囊對(duì)小鼠變應(yīng)性接觸性接觸性皮炎有明顯的治療作用。百癬夏塔熱膠囊明顯抑制小鼠DNFB誘發(fā)的ACD,表明該藥具有抑制T淋巴細(xì)胞參與的過(guò)敏反應(yīng),同時(shí)對(duì)DNFB引起的炎癥反應(yīng)有抑制作用。百癬夏塔熱膠囊對(duì)小鼠接觸性皮炎的免疫調(diào)節(jié)作用除了直接抑制Th1細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子 TNF-α表達(dá)外,還可能通過(guò)直接或間接抑制NF-κ B的活化,從而進(jìn)一步抑制NF-κ B調(diào)控的促炎細(xì)胞因子。從而對(duì)ACD起到治療作用。目前,治療變應(yīng)性接觸性皮炎的主要藥物是抗組胺藥及激素,百癬夏塔熱膠囊可以作為治療的有益的補(bǔ)充。

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