類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎遺傳多態(tài)性及NSAID藥物臨床療效的研究

劉瑞平,趙公吟,韓云芳,張 輝,徐南偉

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州二院,1.骨科;2.中心實(shí)驗(yàn)室,江蘇常州,213003)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種常見的慢性炎性疾病,病因還未完全明確,但在世界上有數(shù)百萬人患病。RA常見的臨床表現(xiàn)包括從輕微的關(guān)節(jié)腫脹到嚴(yán)重的進(jìn)行性的骨及軟骨破壞的多關(guān)節(jié)炎。同其他自身免疫性疾病相似,女性比男性更加易感。RA的發(fā)病過程還不是完全明確,除了感染,激素和環(huán)境因素等原因,一些證據(jù)表明RA與遺傳因素有關(guān)。研究表明RA發(fā)病的一致性在同卵雙生子(15%)遠(yuǎn)高于異卵雙生子(3.6%),RA的遺傳因素占50%～60%,提示患者的遺傳背景在RA發(fā)病過程中起重要作用[1]。

環(huán)氧合酶(COX)又稱為環(huán)氧化酶和前列腺素(PG)內(nèi)過氧化物合成酶。COX的主要功能是將花生四烯酸轉(zhuǎn)變成PG,PG參與體內(nèi)的許多生理和病理過程。COX家族主要有兩個(gè)亞型,分別是COX-1和COX-2。環(huán)氧合酶在許多生物進(jìn)程中起重要作用,包括免疫功能和炎癥、細(xì)胞增殖、血管生成等,與 RA發(fā)病過程有關(guān)。PG和COX-2在炎癥過程中起重要作用,COX-2同時(shí)表現(xiàn)出炎癥前體細(xì)胞因子或抗炎特性,COX-2抑制劑現(xiàn)在被用來治療RA[2-3]。許多研究發(fā)現(xiàn)個(gè)體對(duì)RA的發(fā)生有易感性,與個(gè)體遺傳差異有關(guān),因此可以進(jìn)行COX-2基因多態(tài)性與RA發(fā)生易感性的研究。本研究以MALDI-TOF MS技術(shù),進(jìn)行以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例-對(duì)照研究,探討COX-2單核苷酸多態(tài)性與發(fā)生危險(xiǎn)因素的相關(guān)性,以及NSAID藥物的臨床療效,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇2010年9月～2011年4月在常州第二人民醫(yī)院、常州第一人民醫(yī)院和常州市中醫(yī)院收集的RA患者214例,RA患者均符合1987年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)修訂的RA分類標(biāo)準(zhǔn)[4]。對(duì)照組478例,為同一時(shí)期在上述3家醫(yī)院住院的非免疫性疾病患者,主要為外傷性疾病。所有對(duì)象來自江蘇省常州市及其周邊地區(qū),均為漢族人群。2組年齡、性別差異均無顯著性(P>0.05)。其中有60例的RA患者給予NSAID藥物治療,并進(jìn)行了詳細(xì)的隨訪。

1.2 方法

1.2.1 分析基因多態(tài)性:在獲得書面的知情同意書后,對(duì)RA患者及對(duì)照均使用特定的調(diào)查表進(jìn)行問卷調(diào)查,空腹采集2 mL EDTA抗凝血,1 h內(nèi)用4 000 r/min離心 10 min,分離白細(xì)胞層,采用Qiagen DNA提取試劑盒提取DNA。SNP分型采用美國(guó) Sequenom公司的 MassARRAYTM Analyzer技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行SNP檢測(cè)。PCR引物和單堿基延伸引物均由Assay Designer 3.1軟件包設(shè)計(jì)。引物合成后,所有DNA樣本稀釋到30～50 ng/μ L,取 1 μ L,將其與 1.8 μ L 水 、0.5 μ L 10×PCR 緩沖 液 、0.4 μ L MgCl2 、0.1 μ L dNTP 、1 μ L PCR 引 物以及 0.2 μ L HotStar Taq 酶(Qiagen)混合在一起。PCR反應(yīng)條件:95℃,2 min;95℃,30 s;56℃,30 s;72℃,1 min;共45個(gè)循環(huán);最終 72℃5 min,降溫至 25℃。PCR擴(kuò)增后,剩余的dNTP將被去磷酸消化掉,反應(yīng)體系包括 1.53 μ L 水 、0.17 μ L SAP 緩沖液 、0.3 U 堿性磷酸酶。該反應(yīng)在37℃進(jìn)行40 min,然后85℃,5 min使酶失活;降溫至25℃。堿性磷酸酶處理后,針對(duì)SNP的單堿基延伸引物在下列反應(yīng)體系中進(jìn)行 :0.619 μ L 水 、0.2 μ L 10×iPLEX 緩沖液 、0.2 μ L 終止混合物 、0.041 μ L iPLEX 酶,0.94 μ L的延伸引物。單堿基延伸反應(yīng)在下列條件下進(jìn)行:94℃,30 s;94℃,5 s;52℃,5 s;80℃,5 s;5個(gè)內(nèi)部循環(huán);72℃,3 min。共40個(gè)外部循環(huán);降溫至25℃。最后在終止反應(yīng)物中加入6 mg陽離子交換樹脂脫鹽,混合后加入25 μ L水懸浮。使用 MassARRAY Nanodispenser將最終的分型產(chǎn)物點(diǎn)樣到一塊384孔的 spectroCHIP(Sequenom)上,并用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。最終結(jié)果由MassARRAYRT軟件系統(tǒng)實(shí)時(shí)讀取,并由 MassARRAY Typer 4.0軟件系統(tǒng)完成基因分型分析,見圖1。10%的樣本接受重復(fù)檢測(cè),以驗(yàn)證檢測(cè)的準(zhǔn)確度。計(jì)算COX-2多態(tài)性位點(diǎn)變異基因型與野生型純合型致RA的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度。

圖1 RACOX-2 rs5275多態(tài)性位點(diǎn)MALDI-TOF MS基因分型圖

1.2.2 用藥:60例使用NSAID藥物的 RA患者,用藥3月后調(diào)查藥物療效,檢查使用藥物前后壓痛和腫脹的關(guān)節(jié)數(shù),實(shí)驗(yàn)室測(cè)量使用藥物前后患者的血沉,并進(jìn)行DAS28評(píng)分。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況比較

本研究包含有214名 RA患者和380名對(duì)照,其中有60例患者使用NSAID藥物,RA患者平均年齡(54.63±15.77)歲,對(duì)照(54.84±10.45)歲,RA患者中有28.5%患者為男性,對(duì)照中有25.3%為男性。年齡與性別構(gòu)成無顯著性差異,分析遺傳多態(tài)性P值分別為0.859和0.378。顯示年齡性別匹配較好,見表1。

2.2 遺傳平衡檢驗(yàn)

對(duì)照人群的COX-2位點(diǎn)基因型經(jīng)過Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn),P值符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P=0.131),說明該人群COX-2位點(diǎn)基因型頻率處于平衡狀態(tài),具有群體代表性。

2.3 COX-2位點(diǎn)基因型分布與RA易感性關(guān)系

在單個(gè)位點(diǎn)的分析中,作者發(fā)現(xiàn)RA病例和對(duì)照中COX-2多態(tài)性位點(diǎn)頻率無明顯差異。在COX-2位點(diǎn)中,Logistic回歸發(fā)現(xiàn)與攜帶COX-2 T T基因型的個(gè)體相比較,攜帶COX-2 CC等位基因型與RA的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無明顯相關(guān)(OR=1.17,95%CI=0.53～2.54);Logistic回歸發(fā)現(xiàn)隱性模型中相對(duì)于T T+TC基因型,攜帶CC基因型與RA的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(OR=1.08,95%CI=0.50～2.34)。見表2。

表1 RA病例及對(duì)照的基本信息( x±s)

表2 C OX-2 rs5275多態(tài)性和RA危險(xiǎn)關(guān)系的Logistic回歸分析[n(%)]

2.4 NSAID藥物治療效果的比較

分析NSAID藥物使用前后的療效,治療前DAS28評(píng)分為(6.06±1.10),治療后 3個(gè)月DAS28評(píng)分為(4.67±1.06),DAS28評(píng)分明顯降低(P<0.01),表明NSAID藥物治療具有顯著的臨床療效。

3 討 論

在本病例對(duì)照研究中,研究了中國(guó)人群中COX-2 rs5275多態(tài)性位點(diǎn)和RA的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)COX-2 rs5275多態(tài)性可能與RA發(fā)病危險(xiǎn)性無關(guān)。同時(shí)本研究證明NSAID藥物治療RA具有顯著的臨床療效。炎癥反應(yīng)是RA的發(fā)病的重要的分子機(jī)制之一,另一重要機(jī)制是刺激因素誘導(dǎo)了核內(nèi)基因表達(dá)的改變,從而誘發(fā)滑膜細(xì)胞的增殖。COX可以催化使游離的花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素H2(前列腺素的前體)、前列環(huán)素和血栓素[5]。前列腺素E2是RA中關(guān)鍵的影響關(guān)節(jié)的炎性介質(zhì),前列腺素E2除介導(dǎo)疼痛和炎癥外,前列腺素E2升高可導(dǎo)致關(guān)節(jié)和骨的侵蝕[6]。前列腺素E2的產(chǎn)生與對(duì)代謝性刺激物(例如炎癥細(xì)胞因子前體、脂多糖等)的反應(yīng)導(dǎo)致的COX-2(炎性區(qū)域前列腺素 E2產(chǎn)生的限速酶)升高有關(guān)[7-8]。

COX-2表達(dá)也可由轉(zhuǎn)錄因子如核因子κ-B(NF-κ B)誘導(dǎo),隨后,COX-2活化可能通過活化過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPAR-γ)及改變膜屏障功能從而抑制NF-κ B[9-10]。之前的研究發(fā)現(xiàn)COX-2 rs5275可能與韓國(guó)人群中顱內(nèi)出血易感性無關(guān),但與非小細(xì)胞肺癌放療后毒性有關(guān)[11-12]。但本研究未發(fā)現(xiàn)COX-2 rs5275多態(tài)性與RA易感性有關(guān)。

本研究對(duì)照基因型符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P=0.131),說明對(duì)照人群選擇具有代表性。NSAID類藥物對(duì)RA療效顯著,但也要注意它們的不良反應(yīng),非選擇的NSAID類藥物具有較強(qiáng)的胃腸道反應(yīng)和腎毒性,選擇性的COX-2抑制劑雖然胃腸道反應(yīng)小,其臨床療效亦降低,同時(shí)可增加心腦血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

本研究存在以下不足:①本研究以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例對(duì)照研究,不可能完全排除選擇偏倚,需要進(jìn)行大樣本的以人群為基礎(chǔ)的病例對(duì)照研究以闡明COX-2 rs5275多態(tài)性與 RA危險(xiǎn)性關(guān)系;②盡管本研究樣本數(shù)量為214例RA和478例對(duì)照,但本研究的樣本量仍然不能完全發(fā)現(xiàn)頻率較低的變異與RA危險(xiǎn)性關(guān)系;③需要進(jìn)行COX-2 rs5275多態(tài)性功能學(xué)的研究,需要在以后的研究中進(jìn)一步闡明功能學(xué)的相關(guān)性,以及進(jìn)行藥物遺傳學(xué)方面的研究,如COX-2選擇性抑制類NSAID藥物的遺傳相關(guān)性等。

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