p300/CBP、Smad4在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)

王恩旺，楊小龍，鄧小樂

(1.馬鞍山市人民醫(yī)院 心胸外科，安徽 馬鞍山 243000;2.皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院 心胸外科，安徽 蕪湖 241001)

p300/CBP為組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，是同源轉(zhuǎn)錄輔助激活因子，具有內(nèi)在乙酰轉(zhuǎn)移酶活性。Smad4為抑癌基因，是目前發(fā)現(xiàn)的惟一一種CO-Smads，其蛋白產(chǎn)物是TGF-β超家族受體的直接底物。p300/CBP可通過與Smads結(jié)合增強(qiáng)TGF-β誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)的方法(SABC法)，測定肺癌和正常肺組織中p300/CBP、Smad4蛋白的表達(dá)，觀察其結(jié)果與肺癌臨床病理的關(guān)系，并分析它們之間的相關(guān)性，旨在探討 p300/CBP、Smad4在NSCLC發(fā)病機(jī)制中的作用，同時(shí)為p300/CBP、Smad4用于NSCLC的抗腫瘤治療提供一定的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選用2008年1月～2009年1月皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院術(shù)前未經(jīng)放療和化療的原發(fā)性肺癌手術(shù)標(biāo)本(石蠟包埋)60例。取上述標(biāo)本中距離腫瘤邊緣6 cm以上的正常肺組織20例、并經(jīng)病理檢查排除腫瘤累及。標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，其中一片行HE常規(guī)染色用于病理診斷。組織病理分型、分級由病理科診斷。60例NSCLC中男性43例，女性17例。≥55歲33例，＜55歲27例。病理分型:肺鱗癌38例，肺腺癌22例。中心型肺癌28例，周圍型肺癌32例。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例。按1997年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)新修訂的肺癌TNM分期:ⅠA期3例、ⅠB期14例、ⅡA期12例、ⅡB期17例、ⅢA期14例，無ⅢB、Ⅳ期病例。腫瘤直徑＞3 cm 29例，≤3 cm 31例。分化程度:高分化+中分化為39例，低分化21例。

1.2 主要試劑 Smad4濃縮型兔多克隆抗體(武漢博士德)，p300/CBP濃縮型鼠抗人單克隆抗體(NeoMarker)，SABC免疫組化試劑盒和3-3'二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(武漢博士德)。

1.3 方法 免疫組織化學(xué)SABC法60例肺鱗癌和肺腺癌均行 Smad4(1∶50)、p300/CBP(1∶100)免疫組織化學(xué)染色。染色方法按說明書進(jìn)行。以磷酸緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照，Smad4、p300/CBP陽性切片作為陽性對照。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 Smad4蛋白定位于肺泡上皮細(xì)胞漿(胞核)或癌細(xì)胞漿(胞核)內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色細(xì)小顆粒者為陽性染色。根據(jù)染色陽性的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比分為:陽性細(xì)胞＜20%為陰性，陽性細(xì)胞≥20%為陽性表達(dá)。

1.4.2 p300/CBP蛋白定位于癌細(xì)胞核內(nèi)和支氣管黏膜上皮細(xì)胞核內(nèi)，部分呈核-漿型，細(xì)胞核被染成棕黃色為p300/CBP陽性表達(dá)。每張切片在400倍鏡下觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，共計(jì)500個(gè)細(xì)胞，無p300/CBP陽性表達(dá)者計(jì)0分，陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，11% ～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。再按染色強(qiáng)度評分:無色為0，淡色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。最后將陽性細(xì)胞所占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分比的染色分級與強(qiáng)度分級兩項(xiàng)指標(biāo)評分相乘，得出染色等級評分:“-”(0～2)，“+”(3～4)，“?”(6～8)，“?”(9～12)?！?”為陰性表達(dá)，“+”、“?”及“?”為陽性表達(dá)，其中“?”和“?”為過度表達(dá)［1］。

1.4.3 正常肺組織分級參照上述標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用χ2檢驗(yàn)分析各組計(jì)數(shù)資料;NSCLC中p300/CBP表達(dá)與腫瘤各臨床病理特征之間的分析，不同分組之間采用秩和檢驗(yàn)(Mann-Whitney U，或 Kruskal-Wallis Test);正常肺組織中及NSCLC中p300/CBP、Smad4的表達(dá)、相互之間的關(guān)系及雙向有序資料采用Spearman等級相關(guān)分析。P＜0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

p300/CBP在正常肺組織中呈中-低表達(dá)，陽性表達(dá)率為35.0%(7/20)，未發(fā)現(xiàn)有過表達(dá)(0/20)，在NSCLC組織中陽性表達(dá)率為65.0%(39/60)，過表達(dá)率為51.7%(39/60)，主要表達(dá)于細(xì)胞核(見圖1～6)。

Smad4在正常肺組織中呈高表達(dá)，陽性表達(dá)率為90.0%(18/20)，在NSCLC組織中逐漸降低呈中-高度表達(dá)，陽性表達(dá)率為63.3%(38/60)，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中(見圖1～6)。

p300/CBP和Smad4均與NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期等臨床病理學(xué)參數(shù)有關(guān)(P＜0.05)，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，均隨著腫瘤分期的增高而降低(見表1、2)。

p300/CBP的表達(dá)還與NSCLC分化有關(guān)，在中、高分化肺癌細(xì)胞的表達(dá)明顯高于在低分化肺癌細(xì)胞中的表達(dá)(P ＜0.05)，呈輕度負(fù)相關(guān) (rs=-0.287，P=0.026)，見表1。

p300/CBP、Smad4在NSCLC組織中陽性表達(dá)率呈中度負(fù)相關(guān)(rs=-0.413，P=0.001)，見表3。

表1 p300/CBP在NSCLC臨床病理特征不同組之間的表達(dá)Tab 1 p300/CBP expression by classification of clinicopathologic features in NSCLC

表2 Smad4在NSCLC臨床病理特征不同組之間的相關(guān)性Tab 2 Correlation of Smad4 expression by classification of the clinicopathologic features in NSCLC

表3 p300/CBP、Smad4在NSCLC表達(dá)關(guān)系Tab 3 Relationship between expression of Smad4 and p300/CBP in NSCLC

4 討論

p300/CBP是同源轉(zhuǎn)錄輔助激活因子，分別位于22p13和16p13.3，具有內(nèi)在的乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，催化可逆的組蛋白乙?；300/CBP本身亦可減緩由染色質(zhì)本身結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的啟動(dòng)子抑制作用和恢復(fù)靶基因啟動(dòng)子基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄器效應(yīng)［2］。

p300/CBP作為原癌蛋白，可抑制腫瘤，但可有異?；罨瑸檎T導(dǎo)腫瘤的癌蛋白。p300/CBP是細(xì)胞周期負(fù)調(diào)節(jié)基因。p300/CBP通過活化AP-1，調(diào)控cyclin D1基因表達(dá)。E2F家族過度表達(dá)與肺癌密切相關(guān)，并且隨腫瘤分期升高而增高。E2F可在p300/CBP賴氨酸殘基上被乙?；?，在分子水平上CDK介導(dǎo)p300/CBP和E2F-1相互作用、促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入不可逆的過程［3］。p21WAF/CIP1可上調(diào)p300/CBP活性表達(dá)，從而抑制細(xì)胞周期運(yùn)行。DNA的復(fù)制和修復(fù)同樣需要p300/CBP的參與。p53突變是不同類型肺癌中最常見的基因改變，且出現(xiàn)的頻率比其他腫瘤高。突變型p53不僅失去了正常的抑癌作用，而且還促進(jìn)惡性轉(zhuǎn)化。p300/CBP的CH1區(qū)域?qū)53有泛素連接酶活性，p300/CBP通過Mdm2依賴或非依賴機(jī)制調(diào)節(jié)p53泛蛋白化作用和降解，有助于控制 p53 穩(wěn)定性［4］。p53 可被包含 p53、Mdm2 和p300/CBP的三元絡(luò)合物降解。在p53信號(hào)通路中，p300/CBP還通過乙?；筂dm2失活，引發(fā)細(xì)胞凋亡［5］。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，p300/CBP在NSCLC的性別、年齡、腫瘤部位、病理類型各不同組之間的表達(dá)，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。p300/CBP在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中陽性表達(dá)明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織(P＜0.05)，呈輕度負(fù)相關(guān) (rs=-0.372，P=0.003)。p300/CBP 的表達(dá)隨著腫瘤級別的增高而降低，在中、高分化肺癌細(xì)胞中的陽性表達(dá)明顯高于在低分化肺癌細(xì)胞中的表達(dá)(P＜0.05)，呈輕度負(fù)相關(guān) (rs=-0.287，P=0.026)。p300/CBP的表達(dá)亦隨著腫瘤分期的增高而降低，三組之間的表達(dá)有明顯差異 (P＜0.05)，并呈中度負(fù)相關(guān) (rs=-0.573，P=0.001)。CBP 在早期上皮細(xì)胞癌中過度表達(dá)已被證實(shí)，CBP的過度表達(dá)、或優(yōu)先使用是通過特定活躍的轉(zhuǎn)錄因子，或兩者聯(lián)合體，并且在肺癌中不抑制細(xì)胞增殖和死亡［6］。Smad4系位于l8q21.1上的抑癌基因，其蛋白產(chǎn)物是TGF-β超家族受體的直接底物。TGF-β家族是為數(shù)不多的內(nèi)源性細(xì)胞生長調(diào)節(jié)蛋白，主要調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、遷移、免疫反應(yīng)、血管生成、凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。TGF-β信號(hào)通路失調(diào)能夠促進(jìn)腫瘤發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移的進(jìn)程，恢復(fù)TGF-β信號(hào)通路則可減少人類腫瘤(如肺癌)的發(fā)生［7］。TGF-β需Smads將刺激所產(chǎn)生的信息從細(xì)胞內(nèi)傳遞至細(xì)胞核。Smad4蛋白是目前發(fā)現(xiàn)的惟一一種CO-Smads，因?yàn)槠淇梢院推渌鸖mad蛋白形成復(fù)合體，有效地傳遞任務(wù)而居關(guān)鍵性地位，目前對其調(diào)控TGF-β誘導(dǎo)的基因表達(dá)研究較多:Ke Z等［8］應(yīng)用免疫組化等方法分析肺癌組織中各種不同血管生成因子表達(dá)以及瘤內(nèi)微血管密度，結(jié)果顯示Smad4表達(dá)缺失和瘤內(nèi)微血管密度具有顯著的相關(guān)性，提示Smad4作為調(diào)節(jié)因子在肺癌的血管發(fā)生中起著重要的作用。Smad4基因發(fā)生突變，將伴隨著癌癥的發(fā)生。若調(diào)節(jié)Smad4蛋白在細(xì)胞中的功能，可以進(jìn)一步抑制癌癥的生成［9，10］。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常肺組織Smad4陽性表達(dá)率為90.0%，肺癌組織中Smad4蛋白的表達(dá)率為63.3%，低于正常組織(P＜0.05)。Smad4在NSCLC的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小和病理類型和分化程度各不同組之間的表達(dá)，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Smad4在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中陽性表達(dá)明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織(P＜0.05)，呈輕度正相關(guān)(rs=0.295，P=0.022)。Smad4陽性表達(dá)率隨著腫瘤分期的增高而降低 (P＜0.05)，呈中度正相關(guān)(rs=0.487，P=0.000)。提示Smad4表達(dá)與肺癌發(fā)生發(fā)展、生物學(xué)行為及其預(yù)后有密切關(guān)系，其作用機(jī)制與Smad4本身的生物學(xué)作用有關(guān)。

p300/CBP可通過與Smads結(jié)合增強(qiáng)TGF-β誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性。p300/CBP在Smad4的存在下，增強(qiáng)TGF-β及 Smads誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性。p300/CBP、Smad4的有機(jī)結(jié)合，以及協(xié)同激活子的參與，能使TGF-β 誘導(dǎo)的基因表達(dá)增強(qiáng)［11］。p300/CBP、Smads蛋白的低表達(dá)可使TGF-β的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的中斷，從而使上皮細(xì)胞逃脫了TGF-β對其生長抑制作用。Smads、p300/CBP可作為整體與不同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，但其他轉(zhuǎn)錄因子也可和Smads競爭性地與p300/CBP結(jié)合、或直接干擾Smads而妨礙Smads介道的轉(zhuǎn)錄。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:正常肺組織中p300/CBP與 Smad4的表達(dá)無相關(guān)(rs=-0.105，P=0.660)，NSCLC組織中 p300/CBP與Smad4的表達(dá)呈中度負(fù)相關(guān)(rs=-0.413，P=0.001)，且均與NSCLC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和 TNM分期相關(guān)，提示在NSCLC的一系列病程發(fā)展過程中，高表達(dá)的p300/CBP與Smad4的協(xié)同作用可能是NSCLC腫瘤細(xì)胞永生化的重要因素。故聯(lián)合檢測p300/CBP和Smad4的表達(dá)，在預(yù)測NSCLC的惡性生物學(xué)行為方面可能比單因素檢測更具有意義，預(yù)計(jì)聯(lián)合使用分別針對 p300/CBP及 Smad4靶向藥物，有望提高NSCLC治療的有效率。

總之，肺癌的發(fā)生是多因素、多步驟的過程，可同時(shí)有原癌基因激活和抑癌基因滅活。隨著對p300/CBP結(jié)構(gòu)和功能等相關(guān)研究的不斷深入，將有助于在人類細(xì)胞中具有抗癌藥物一樣功能的p300/CBP抑制劑的問世，為腫瘤的防治工作帶來新的契機(jī)。

［1］姚廣裕，楊名添，戎鐵華，等.MT1-MMP在乳腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義［J］.癌癥，2004，23(z1):1482-1486.

［2］KARAMOUZIS MV，KONSTANTINOPOULOS PA，PAPAVASSILIOU AG.Roles of CREB-binding protein(CBP)/p300 in respiratory epithelium tumorigenesis［J］.Cell Research，2007，17:324-332.

［3］林福地，謝慶祥，張閩峰，等.轉(zhuǎn)錄因子E2F-1在肺癌組織中表達(dá)的意義［J］.腫瘤防治雜志，2003，10(12):1263-1264.

［4］PAN X，ZHAO J，ZHANG WN，et al.Induction of SOX4 by DNA damage is critical for p53 stabilization and function［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(10):3788-3793.

［5］WANG X，TAPLICK J，GEVA N，et al.Inhibition of p53 degradation by Mdm2 acetylatio［J］.FEBS Lett，2004，561(1-3):195-201.

［6］KISHIMOTO M，KOHNO T，OKUDELA K，et al.Mutations and deletions of the CBP gene in human lung cancer［J］.Clin Cancer Res，2005，11:512-519.

［7］ANUMANTHAN G，HALDER SK，OSADA H，et al.Restoration of TGF-beta signaling reduces tumorigenicity in human lung cancer cells［J］.Br J Cancer，2005，93(10):1157-1167.

［8］KE Z，ZHANG X，MA L，et al.Expression of DPC4/Smad4 in nonsmall-cell lung carcinoma and its relationship with angiogenesis［J］.Neoplasma，2008，55(4):323-329.

［9］KENTER GG，SPIJKER HS，ULJEE S，et al.Expression of Smad2 and Smad4 in cervical cancer:absent nuclear Smad4 expression correlates with poor survival［J］.Mod Pathol，2008，21(7):866-875.

［10］WANG B，SUZUKI H，KATO M.Roles of mono-ubiquitinated Smad4 in the formation of Smad transcriptional complexes［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，376(2):288-292.

［11］NISHIHARA A，HANAI J，EMAMURA T，et al.E1A inhibits transforming growth factor-beta signaling through binding to Smad proteins［J］.J Biol Chem，1999，274(40):28716-28723.