臧瑩安,盧 頔,胡 波,宋 帥,李 淼,李春玲
(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動物科學(xué)系,廣東 廣州 510225;2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所,廣東 廣州 510640)
豬鏈球菌?。⊿wine streptococcsis)是由多種鏈球菌感染引起的危害養(yǎng)豬業(yè)的一種國家規(guī)定的二類動物疫病。鏈球菌雖然抵抗力不強,但由于抗生素的濫用,易產(chǎn)生耐藥性,導(dǎo)致治療失敗[1-2]。所以,本試驗通過對廣東部分地區(qū)發(fā)病豬群豬鏈球菌可疑菌進行分離鑒定,進而對其進行藥敏試驗,為各豬場合理用藥提供依據(jù)。
1.1 儀器 HZQ-X100振蕩培養(yǎng)箱,購自哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠;電熱恒溫培養(yǎng)箱,購自上海躍進醫(yī)療器械一廠;基因擴增儀,購自杭州博日科技有限公司;穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀,購自北京市六一儀器廠;紫外透射分析儀,購自珠海星馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司。
1.2 試劑 新生牛血清,托-休二氏液體培養(yǎng)基(THB),托-休二氏體培養(yǎng)基(THA),細(xì)菌微量生化反應(yīng)管,藥敏紙片和質(zhì)控菌株,均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。
1.3 實驗動物 18~20g雄性昆明系小鼠,購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。
1.4 細(xì)菌分離培養(yǎng) 將疑似豬鏈球菌菌株S1~S20接種在THB培養(yǎng)基中,置于37℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16~18h后,在超凈工作臺中采用劃線分離培養(yǎng)法用接種環(huán)挑取菌液接種于血平板上,37℃培養(yǎng)14~16h,經(jīng)培養(yǎng)無雜菌者,選取α溶血、光滑圓形、半透明、直徑1~2mm的小菌落,每個樣品挑去3~6個疑似菌落,分別接種3mL THB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)16~18h后,仔細(xì)觀察分離菌經(jīng)培養(yǎng)后的生長情況,并挑取單個可疑菌落和液體培養(yǎng)物分別作革蘭染色鏡檢。
1.5 生化特性分析 無菌操作,用移液槍分別吸取上述的各分離菌液各100μL于3mLTHB培養(yǎng)液中,置于37℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16~18h后,分別做生長基水解試驗和糖發(fā)酵試驗。
1.6 藥敏試驗 按照紙片擴散法[8]操作。對照質(zhì)控菌株接種于TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)OD600值在0.08~0.1左右時進行藥物敏感試驗。
1.7 動物試驗 將70只清潔級小鼠平均分為7組,其中一組為生理鹽水對照組。隨機抽取6個分離株先接種普通血平板,37℃培養(yǎng)24h后,挑取單菌落接種含5%犢牛血清的THB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)16h。各菌平板法計數(shù)后,調(diào)整菌液濃度至3×108CFU/mL。每組腹腔接種0.5mL/只。觀察記錄小鼠臨床發(fā)病和死亡情況,若出現(xiàn)小鼠死亡,立即剖檢。用接種環(huán)沾取死亡小鼠心臟、肺和肝臟在血平板上劃線,經(jīng)培養(yǎng)無雜菌者,挑取單個菌落接種于THB培養(yǎng)液中培養(yǎng)16~18h后,仔細(xì)觀察分離菌的生長情況,并對液體培養(yǎng)物做PCR檢測。
1.8 PCR檢測 本試驗采用的引物序列(5′-3′)是CAGTATTTACCGCATGGTAGATAT,GTAAGATACCGTCAAGTGAGAA。片段大小為294 bp。兩個特異性PCR擴增均采用25μL反應(yīng)體系。在反應(yīng)管中依次加入10×PCR Buffer 2.5μL、25 mmol/L MgCl22.0μL、2.5mmol/L dNTPs 2.0 μL、10pmol/μL 引物各0.5μL、模板1.0μL、5 U/μLTaq酶0.15μL,再加ddH2O調(diào)整終體積至25μL。最后置于PCR擴增儀中經(jīng)94℃變性5min后進入循環(huán),94℃30s,60℃1min,72℃1.5min,35個循環(huán)后72℃保溫10min。同時設(shè)陰、陽性對照。將得到的PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳分離,紫外燈下照相記錄。
2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果 可觀察到該菌溶血,呈直徑1~2mm的圓形、微突、表面光滑濕潤、小菌落形式存在。革蘭染色后呈紫色。在液體培養(yǎng)基中呈長鏈狀,一般由8~15個球菌排成鏈狀,無鞭毛,無芽孢,不運動,無莢膜,無兩極著色現(xiàn)象。
2.2 生化試驗結(jié)果 鑒定的菌株生化特性穩(wěn)定。菌株對蔗糖、乳糖、淀粉、pH值9.6肉湯、葡萄糖磷酸鹽胨水等易發(fā)酵,對棉子糖、蕈糖、果糖等糖類的發(fā)酵,菌株間有差異;對硫化氫、馬尿酸鈉、枸櫞酸鹽等無機鹽類物質(zhì)及6.5%高鹽肉湯、40%膽汁肉湯、蛋白胨水等不發(fā)生反應(yīng)。
表1 分離菌株生化反應(yīng)
2.3 動物試驗結(jié)果
2.3.1 臨床癥狀 攻毒后24h,小鼠表現(xiàn)為被毛松亂,精神委靡,行動遲緩,食欲減退,喜趴伏,聚堆,有的小鼠表現(xiàn)呼吸加快、消瘦等癥狀。死亡的小鼠全身多個器官充血、淤血,肝臟,肺臟、腎臟等腫大,有黏性滲出物。生理鹽水對照組未出現(xiàn)小鼠死亡。
2.3.2 細(xì)菌分離和PCR鑒定 死亡小鼠體內(nèi)肺臟、心、肝臟都可以分離到細(xì)菌,細(xì)菌菌落形態(tài)與接種菌一致,經(jīng)PCR鑒定為豬鏈球菌。
2.4 藥敏試驗結(jié)果 由表2可知,20株典型鏈球菌分離株中大部分對阿莫西林敏感,對先鋒霉素Ⅴ、先鋒霉素Ⅵ等藥物中度敏感,對乙酰螺旋霉素、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明、氟苯尼考、潔霉素、四環(huán)素、強力霉素產(chǎn)生了耐藥性。個別菌株產(chǎn)生了非常普遍的耐藥性。
表2 20株豬鏈球菌分離菌的耐藥情況
本試驗通過分離細(xì)菌的形態(tài)觀察、生化試驗、PCR檢測、動物試驗等進行可疑菌的綜合判定,結(jié)果表明,此20株分離菌均為豬鏈球菌。豬鏈球菌的生化特性穩(wěn)定,發(fā)病豬群分離株沒有明顯差別,不同菌株對于個別糖類有利用的區(qū)別。生化指標(biāo)可作為細(xì)菌鑒定的一個參考。同時也佐證了PCR方法作為細(xì)菌鑒定方法的準(zhǔn)確性、精確性。
本試驗對從廣東部分地區(qū)發(fā)病豬分離到的20株菌株進行了13種抗生素的耐藥性檢測,90%~100%的菌株對于大環(huán)內(nèi)酯類/林可胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類都有耐藥性,而部分菌株對青霉素類、頭孢類敏感。85%的菌株對于阿莫西林中度敏感。
根據(jù)中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所2005年對從四川不同地區(qū)病死豬體內(nèi)分離得到的豬鏈球菌2型的藥敏試驗結(jié)果,7個菌株對四環(huán)素、土霉素、多西環(huán)素和鏈霉素耐藥,對于阿米卡星、新霉素和慶大霉素中度敏感,而對于青霉素、頭孢類、氟喹諾酮類、氯霉素類藥物等敏感[3-4]。Marie等分別檢測了1996~2001年間從法國臨床病豬或者不同國家病人體內(nèi)分離的共135株豬鏈球菌對于臨床常用的13種抗菌藥物的耐藥性,檢測結(jié)果表明,幾乎所有的菌株都對青霉素G、阿莫西林、頭孢噻呋、氟苯尼考、慶大霉素、桿菌肽鋅敏感,耐藥性最為嚴(yán)重的是多西環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯類以及林可胺類抗生素,僅有幾株菌株出現(xiàn)對鏈霉素和卡那霉素的高水平耐藥[5]??梢钥闯觯i鏈球菌在不同國家和地區(qū)的耐藥性具有一定的差異,但是基本上對于青霉素類、頭孢類都表現(xiàn)為高度敏感,而對于大環(huán)內(nèi)酯類/林可胺類、磺胺類和四環(huán)素等的耐藥性則較為嚴(yán)重。目前,人們對豬鏈球菌的耐藥機理進行了深入的研究。PCR檢測結(jié)果表明,耐藥性的產(chǎn)生主要是細(xì)菌核糖體甲基化的結(jié)果[6-7]。研究表明,細(xì)菌長時間承受著多種抗生素選擇的壓力,因此,只有攜帶多種耐藥決定子的細(xì)菌才得以生存,這些耐藥決定子一般位于轉(zhuǎn)座子中,可在不同菌種、菌株間傳遞,造成細(xì)菌對抗生素的普遍交叉耐藥[9-10]。不同地區(qū)的耐藥情況有差別,而地區(qū)上相近的分離株的抗生素抗性和多重耐藥性均較為相似。這可能是豬場地理位置較近,有利于耐藥菌株傳播造成的。從豬場管理和耐藥性分布情況來看,管理越規(guī)范、衛(wèi)生和隔離條件越好的豬場其菌株的分離數(shù)越少,分離株的耐藥性情況也越低。所以,豬場的管理能力、衛(wèi)生隔離條件、豬源等都可能影響豬的帶菌程度和菌株耐藥性變化。
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