RP-HPLC法測(cè)定變通丸中鹽酸小檗堿的含量Δ

李明月，楊驚宇，劉西京，倪建新，蔡昌龍(.廣東東莞市塘廈醫(yī)院，東莞市57；.廣東深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院，深圳市58；.廣東深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院，深圳市58)

藥對(duì)是中藥配伍中的最小單位，為歷代醫(yī)藥學(xué)家所重視。黃連-吳茱萸藥對(duì)的應(yīng)用歷史悠久，臨床根據(jù)不同情況，經(jīng)常變換黃連-吳茱萸的配伍比例，達(dá)到辯證論治的目的，有左金丸(6∶1)、變通丸(又叫茱萸丸，1∶1)和反左金丸(1∶6)等，均通過改變?cè)撍帉?duì)配伍比例而來，常用于脾胃功能失調(diào)有關(guān)的疾病[1，2]。其中，變通丸原方早在北宋《太平圣惠方·治水泄諸方》中就有記載，由黃連和吳茱萸按1∶1組成，主治虛寒型下痢水瀉。目前研究表明，黃連中有效成分為小檗堿型生物堿，具有抗病原微生物等作用[3]。筆者在參照文獻(xiàn)[4～8]的基礎(chǔ)上，建立了以反相高效液相色譜(RP-HPLC)法測(cè)定變通丸中鹽酸小檗堿含量的方法。

1 儀器與試藥

2695-2998 HPLC儀，包括Waters色譜工作站、紫外檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)；CPA225D電子天平(德國(guó)Sartorius公司)。

鹽酸小檗堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110713-200910)；變通丸(深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院自制，批號(hào):20101111、20101201、20101224)；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:SunFireTMC18(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)；流動(dòng)相:1.5 mmol·L-1十二烷基硫酸鈉溶液(A，以磷酸調(diào)pH 5.0)-乙腈(B)，梯度洗脫(0 min，A∶B＝65∶35；10 min，A∶B＝50∶50；20 min，A∶B＝25∶75)；檢測(cè)波長(zhǎng):265 nm；流速:0.8 mL·min-1；柱溫:25℃；進(jìn)樣量:10 μL。

2.2 供試品溶液的制備

取變通丸粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸-甲醇(1∶100)50 mL，稱定重量，冷浸1 h后加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用鹽酸-甲醇(1∶100)補(bǔ)足減失的重量，搖勻，以微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品15.20 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含鹽酸小檗堿304 μg·mL-1的對(duì)照品貯備液。再精密量取此貯備液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得鹽酸小檗堿系列對(duì)照品溶液。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

取吳茱萸藥材，按制劑工藝制備陰性樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制成缺黃連的陰性對(duì)照溶液。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下，分別精密吸取對(duì)照品貯備液、供試品溶液、缺黃連的陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果，鹽酸小檗堿峰的保留時(shí)間約為15 min，陰性對(duì)照色譜在此處無假陽性峰，表明其他組分對(duì)測(cè)定無干擾；鹽酸小檗堿峰與相鄰峰的分離度＞1.5。理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算應(yīng)≥4000。色譜見圖1。

2.6 線性關(guān)系考察

在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下，精密吸取上述系列對(duì)照品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀中，測(cè)定峰面積。以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝1E+06X+56513(r＝0.9998)。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿的質(zhì)量濃度在60.8～304.0 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn)

在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下，精密吸取對(duì)照品溶液(121.6 μg·mL-1)10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定。結(jié)果，鹽酸小檗堿峰面積的RSD＝0.85%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品適量，共6份，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件各進(jìn)樣1次，測(cè)定。結(jié)果，鹽酸小檗堿含量的RSD＝1.25%(n＝6)，表明此方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下，對(duì)同一供試品溶液于制備后0、4、8、12、24 h進(jìn)樣，每次10 μL，測(cè)定。結(jié)果，鹽酸小檗堿峰面積的RSD＝1.04%(n＝5)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品粉末0.1 g，精密稱定，共6份，分別置50 mL容量瓶中，分別精密加入鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，結(jié)果見表1。

2.11 樣品含量測(cè)定

取變通丸3批，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算。結(jié)果，3批樣品(批號(hào):20101111、20101201、20101224)中鹽酸小檗堿的含量分別為8.06、8.54、8.38 mg·g-1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab 1Results of recovery tests(n＝6)

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

將鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液在210～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果顯示其在230、265、345 nm波長(zhǎng)處有較大吸收且吸收曲線平滑。綜合考慮并參考有關(guān)文獻(xiàn)[4，5]，選擇265 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇

鹽酸小檗堿主要以陽離子形式存在，易與固定相中硅羥基較牢結(jié)合，形成拖尾。在考察了乙腈-水比例、十二烷基硫酸鈉濃度及流動(dòng)相pH值對(duì)分離的影響后發(fā)現(xiàn)，將流動(dòng)相調(diào)整為1.5 mmol·L-1十二烷基硫酸鈉溶液(以磷酸調(diào)pH 5.0)-乙腈(梯度洗脫)時(shí)分離情況良好，既避免了鹽酸小檗堿峰的拖尾現(xiàn)象，又使得樣品中各雜質(zhì)峰能與鹽酸小檗堿峰有效分離。

3.3 供試品制備方法考察

在參考相關(guān)文獻(xiàn)[6～8]的基礎(chǔ)上，對(duì)影響供試品溶液制備的主要因素[提取方法(加熱回流、超聲處理、連續(xù)回流提取)、提取時(shí)間(0.5、1.0、1.5 h)]進(jìn)行了考察，最終優(yōu)化并確定了本文所述供試品溶液制備方法。

本試驗(yàn)建立了以RP-HPLC法測(cè)定變通丸中鹽酸小檗堿含量的方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，本法簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用于變通丸的質(zhì)量控制。

[1]張軍會(huì)，左金丸不同配伍配比的臨床應(yīng)用[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，30(4):49.

[2]楊威，金香蘭，于有華，等，黃連與吳茱萸配伍比例關(guān)系與功能關(guān)系的相關(guān)性分析[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2003，99(11):49.

[3]崔學(xué)軍，黃連及其有效成分的藥理研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥師，2006，9(5):469.

[4]盧榮枝，李嫦珍，李運(yùn)景，等.RP-HPLC法測(cè)定婦潔洗劑中小檗堿的含量[J].中國(guó)藥房，2010，21(27):2539.

[5]蘇松柏，張永萍.采用高效液相色譜法測(cè)定黃連中鹽酸小檗堿含量[J].貴州中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，32(5):14.

[6]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典(一部)[S].2010年版.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:630.

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[8]李寧，韓風(fēng)梅，柳偉，等.反相高效液相色譜法測(cè)定加味左金丸中鹽酸小檗堿和吳茱萸次堿的含量[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2006，41(8):631.