HPLC法測定藏藥螃蟹甲中sesamoside的含量Δ

周世良，張文斌，李茂星，張軍莉(1.成都軍區(qū)機(jī)關(guān)醫(yī)院，成都市610011；.新疆軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗所，烏魯木齊市8006；.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院，蘭州市70050)

螃蟹甲，藏語稱“露木爾”，來源于唇形科糙蘇屬植物螃蟹甲Phlomis younghusbandiiMukerjee的干燥塊根，具有止咳祛痰、祛風(fēng)活絡(luò)、強(qiáng)筋壯骨、清熱消腫等多種功效[1]。該藥收載于歷屆藏藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與1995年部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)藏藥分冊中，但無明確的定性、定量質(zhì)控指標(biāo)[2]。據(jù)文獻(xiàn)[3]報道，不同產(chǎn)地10批螃蟹甲藥材的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜中可以指認(rèn)出4種環(huán)烯醚萜類化合物，其中山梔苷甲酯和sesamoside的峰面積相對較穩(wěn)定且峰面積較高，而8-O-乙酰山梔苷甲酯和pulchelloside-Ⅰ的峰面積相對較小且差異較大。另據(jù)報道，環(huán)烯醚萜苷類化合物具有鎮(zhèn)痛、止血等多種活性[4，5]，可能為螃蟹甲中的有效成分。有關(guān)螃蟹甲中山梔苷甲酯和8-O-乙酰山梔苷甲酯的含量測定已有報道[6，7]，本文首次報道不同產(chǎn)地螃蟹甲藥材及其制劑中sesamoside的含量測定法，以為進(jìn)一步完善螃蟹甲的品質(zhì)評價與質(zhì)量控制方法提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

HPLC儀，包括600型二元梯度泵、996型二極管陣列紫外檢器(美國Waters公司)；SK7200H超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司，功率:350 W，工作頻率:53 kHz)；BP210S電子分析天平(德國Sartorius公司)。

乙腈為色譜純，水為滅菌注射用水，其余試劑均為分析純；sesamoside標(biāo)準(zhǔn)品(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院新藥研究室從螃蟹甲藥材中分離并鑒定，經(jīng)HPLC面積歸一化法計算純度為98.76%)；螃蟹甲對照藥材(中國藥品生物制品檢定所，批號:121407-200401)；螃蟹甲藥材3份，分別收購于西藏林芝、拉薩和四川成都，經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院馬志剛教授鑒定為螃蟹甲(P.younghusbandiiMukerjee)；七味螃蟹甲丸(青海琦鷹生物制藥股份有限公司，規(guī)格:每粒0.25 g，批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字Z20054325，批號:20091203)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Symmetry C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相:乙腈-水(9∶91)；流速:1.0 mL·min-1；檢測波長:235 nm；柱溫:20℃；進(jìn)樣量:10 μL。在此色譜條件下，樣品中sesamoside峰形較好，與其他組分色譜峰可達(dá)基線分離。色譜見圖1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品貯備液的制備

精密稱取干燥至恒重的sesamoside標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置10 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，即得濃度為1000 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，備用。

2.3 供試品溶液的制備

分別取螃蟹甲粉末(過4號篩)1 g和七味螃蟹甲丸4粒，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min，冷卻，再稱定重量，加50%甲醇補足減失的重量，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品貯備液適量，以50%甲醇依次稀釋配制成sesamoside濃度分別為55、165、275、385、495、605、715 μg·mL-1的溶液，各進(jìn)樣10 μL，測定峰面積。以峰面積積分值(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度(c)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A＝9315.1c+21625(r＝0.9998，n＝7)。結(jié)果表明，sesamoside的檢測濃度在55～715 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品貯備液適量，按“2.1”項下色譜條件分別于第1、2、3天各重復(fù)進(jìn)樣5次，進(jìn)樣量為10 μL，記錄峰面積，計算日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果，3 d中日內(nèi)精密度的RSD分別為0.78%、1.54%、0.91%(n＝5)，日間精密度的RSD＝3.77%(n＝3)，表明本方法精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗

取同一批螃蟹甲樣品粉末適量，共6份，分別照“2.3”項下方法制備供試品溶液，每次進(jìn)樣10 μL，測定峰面積。結(jié)果，樣品中sesamoside的平均含量為7.11 mg·g-1，RSD＝1.59%(n＝6)，表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液適量，分別于0、2、4、8、12、24、48、72 h測定峰面積。結(jié)果，RSD＝1.92%(n＝8)，表明供試品溶液在72 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品適量，共6份，精密加入對照品貯備液適量，照“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果(n＝6)Tab 1Results of recovery tests(n＝6)

2.9 樣品含量測定

分別取不同來源的螃蟹甲樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，照“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，進(jìn)樣10 μL，并測定對照品相同位置色譜峰面積，采用外標(biāo)一點法計算sesamoside的含量，結(jié)果見表2。

表2 不同樣品中sesamoside的含量測定結(jié)果(n＝3)Tab 2Results of content determination of sesamoside in different samples(n＝3)

3 討論

sesamoside、山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯和pulchelloside-Ⅰ是螃蟹甲中具代表性的環(huán)烯醚萜苷類成分[8～10]，其中sesamoside的極性較大，分離純化困難。本文采用較低濃度的乙腈為流動相，降低洗脫能力，實現(xiàn)了螃蟹甲藥材及其制劑中sesamoside的基線分離，操作簡單、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高。

文獻(xiàn)報道螃蟹甲藥材中山梔苷甲酯[6]和8-O-乙酰山梔苷甲酯[7]的平均含量分別為(2.53±1.07)mg·g-1和(0.62±0.19)mg·g-1。筆者在不同產(chǎn)地的螃蟹甲藥材和制劑中均檢測到sesamoside成分的存在，且藥材中sesamoside的平均含量為(8.32±1.18)mg·g-1，顯著高于上述山梔苷甲酯和8-O-乙酰山梔苷甲酯的含量?？梢?，測定螃蟹甲藥材及其相關(guān)制劑中sesamoside的含量可以用來評價和控制該藥材及其制劑的質(zhì)量。

[1]中國科學(xué)院《中國植物志》編輯委員會.中國植物志(第65卷第2分冊)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，1995:126、231.

[2]國家藥典委員會編.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(藏藥第一冊)[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，1995:126、231.

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