中藥聯(lián)合FTS抗大鼠梗阻性黃疸肝臟缺血再灌注損傷的研究

張 軍 傅永清 華 晨 陳炳榮 裘華森 王海娜 周 劍浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 杭州 310006

快速康復(fù)外科（fast-track surgery，F(xiàn)TS），最早由丹麥外科醫(yī)生Kehlet等提出[1]，它是指在術(shù)前、術(shù)中及術(shù)后應(yīng)用各種已證實(shí)有效的方法以減少手術(shù)應(yīng)激[2]。FTS已被證實(shí)在縮短住院時(shí)間、降低術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生率、死亡率、返院率及醫(yī)療費(fèi)用等方面較傳統(tǒng)方法有明顯的優(yōu)勢(shì)?？焖倏祻?fù)計(jì)劃已在外科許多疾病中成功應(yīng)用，其中結(jié)直腸切除手術(shù)的快速康復(fù)外科治療方案是其中較為成功的典范之一[3]，近年來(lái)國(guó)際上在心臟外科、泌尿外科、婦科中開(kāi)展快速康復(fù)外科治療也見(jiàn)報(bào)道[4]?？焖倏祻?fù)外科可以減少應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)患者術(shù)后快速康復(fù)[5]。然而肝膽外科中運(yùn)用快速康復(fù)外科理念的研究論文仍較少見(jiàn)。本研究將中藥聯(lián)合快速康復(fù)外科治療手段作為干預(yù)因素，研究在梗阻性黃疸基礎(chǔ)上FTS對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠60只（由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心提供），雌雄各30只，7周齡，體重（200±40）g。隨機(jī)分為假手術(shù)組、非 FTS 組、FTS常規(guī)組及FTS+中藥組，每組各15只。

1.2 藥品及試劑 3%戊巴比妥鈉（美國(guó)sigma公司，批號(hào) P376）；四君子湯（黨參 12g，茯苓 9g，白術(shù)9g，甘草6g，購(gòu)自浙江省中醫(yī)院，由其代煎為濃縮劑）；AST、ALT試劑盒（上海申能德賽技術(shù)有限公司，批號(hào)27016，26013）；蘇木精、伊紅染劑（浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心提供）；原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)羅氏公司，批號(hào)11342000）。

1.3 主要儀器 移液器、天平、DU800分光光度儀、組織勻漿機(jī)等均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型建立 所有大鼠均行膽總管結(jié)扎（common bile ductligation，CBDI）制備為梗阻性黃疸模型，方法如下：大鼠按每100g體重0.13mL劑量的3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，取上腹部正中切口2～3cm，在距肝門(mén)0.5cm處用4-0絲線雙道結(jié)扎膽總管后關(guān)腹。所有操作均嚴(yán)格按照無(wú)菌原則進(jìn)行。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法 本實(shí)驗(yàn)研究共設(shè)置5個(gè)干預(yù)因素，分別是：術(shù)前禁食、禁水12h；術(shù)前生理鹽水灌腸1次；術(shù)中放置腹腔引流管；術(shù)后生理鹽水灌胃1次；術(shù)后禁食6h。以上干預(yù)措施在兩FTS組大鼠均不實(shí)施。FTS+中藥干預(yù)組予中藥2mL分別于術(shù)前1天、手術(shù)當(dāng)天及術(shù)后1天灌胃1次，F(xiàn)TS常規(guī)組則不進(jìn)行該操作。模型制備后第7天，進(jìn)行第二次手術(shù)。假手術(shù)組僅進(jìn)行開(kāi)腹、關(guān)腹操作。非FTS組及兩FTS組均進(jìn)行肝臟缺血再灌注操作。采用5-0血管縫線結(jié)扎門(mén)靜脈，缺血40min，再灌注時(shí)抽掉血管縫線再次開(kāi)放門(mén)靜脈，術(shù)后予常規(guī)補(bǔ)液治療。

2.3 標(biāo)本采集及檢測(cè) 開(kāi)放門(mén)靜脈24h后，3%戊巴比妥鈉溶液麻醉（0.13mL/100g），5mL注射用針筒大鼠心臟取血，打開(kāi)腹腔，用剪刀剪取肝臟組織約5g左右。

2.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

2.4.1 ALT、AST檢測(cè) 血液樣本3 000r/min離心10min分離取血清，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)AST、ALT水平，具體步驟按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

2.4.2 HE染色及TUNEL檢測(cè) 肝臟組織進(jìn)行常規(guī)HE染色，TUNEL法檢測(cè)肝組織細(xì)胞原位凋亡，具體操作方法：切片置60℃烤箱烘烤2h；切片脫蠟；蒸餾水洗2min；高壓熱修復(fù)：高壓鍋內(nèi)放適量自來(lái)水，將修復(fù)液倒入燒杯內(nèi)，將燒杯置于高壓鍋內(nèi)煮沸，將切片放入裝有修復(fù)液的燒杯內(nèi)，蓋緊高壓鍋，加熱至設(shè)定壓力冒氣后持續(xù)2min，自來(lái)水冷卻；3%H2O2溶液阻斷過(guò)氧化物酶，10min；蒸餾水洗 2min，PBS洗3min；滴加一抗，37℃孵育 1h；流水沖洗 3min，蒸餾水洗 3min，PBS 洗 5min；滴加二抗，37℃孵育 60min；流水沖洗3min，蒸餾水洗3min，PBS洗 5min；DAB顯色2min；復(fù)染、透明后封片。HE染色下觀察大鼠肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，免疫組化染色后觀察各組肝臟細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算凋亡指數(shù)（Apoptosis Index，AI）。判斷標(biāo)準(zhǔn)：以光鏡下觀察到肝臟細(xì)胞核呈棕色或棕褐色為原位凋亡細(xì)胞，光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)平均200個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，以百分?jǐn)?shù)表示。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠血清ALT、AST水平 假手術(shù)組與FTS+中藥組、FTS常規(guī)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；假手術(shù)組與非FTS組比較，AST、ALT值后者明顯高于前者（P＜0.05）；非 FTS組與 FTS+中藥組及 FTS常規(guī)組比較，AST、ALT值后兩者明顯低于前者（P＜0.05）；FTS+中藥組與 FTS 常規(guī)組比較，AST、ALT 值后者明顯高于前者（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表2 各組大鼠肝臟細(xì)胞凋亡陽(yáng)性指數(shù)比較（±s）

表2 各組大鼠肝臟細(xì)胞凋亡陽(yáng)性指數(shù)比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，▲P＜0.01；與非 FTS 組比較，△P＜0.05

組 別 n/只 陽(yáng)性指數(shù)/%假手術(shù)組 15 7.48±1.08非 FTS組 15 19.60±1.72▲FTS+中藥組 15 14.90±1.18▲△FTS 常規(guī)組 15 15.75±2.19▲△

表1 各組大鼠血清ALT、AST水平比較（±s）IU/L

表1 各組大鼠血清ALT、AST水平比較（±s）IU/L

注：與非 FTS 組比較，△P＜0.05；與 FTS 常規(guī)組比較，*P＜0.05

組 別 n/只 ALT AST假手術(shù)組 15 224.6±120.9△ 858.2±80.0△非 FTS 組 15 459.0±233.1 1237.8±202.5 FTS+中藥組 15 149.7±72.5△* 711.0±245.7△*FTS常規(guī)組 15 270.1±112.1△ 955.6±156.3△

3.2 大鼠肝臟HE染色形態(tài)學(xué)比較 在200倍光鏡下，各組均存在肝細(xì)胞變性壞死，表現(xiàn)為細(xì)胞核脹大，水樣變，核分裂等，非FTS組出現(xiàn)局部片狀壞死區(qū)，肝小葉中央靜脈周?chē)用黠@；兩FTS組基本肝小葉結(jié)構(gòu)保持完好。

3.3 大鼠肝臟細(xì)胞凋亡情況 各組均可見(jiàn)肝臟細(xì)胞凋亡，見(jiàn)圖1～4（封四），非FTS組及兩FTS組肝臟細(xì)胞凋亡程度明顯高于假手術(shù)組。假手術(shù)組凋亡指數(shù)顯著低于其他各組（P＜0.01），非FTS組高于兩FTS組（P＜0.05），F(xiàn)TS+中藥組與FTS常規(guī)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

4 討論

對(duì)膽汁淤積性黃疸患者進(jìn)行肝臟手術(shù)造成缺血再灌注損傷，是導(dǎo)致患者術(shù)后短期內(nèi)肝功能衰竭的主要原因。肝細(xì)胞的凋亡是肝臟缺血再灌注損傷的重要病理特征，細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的一種方式，直接反應(yīng)了肝功能損害程度。大量肝細(xì)胞短期內(nèi)凋亡勢(shì)必會(huì)造成肝功能失代償，甚者可發(fā)展為肝衰竭。

本實(shí)驗(yàn)研究選取術(shù)前禁食、禁水12h，術(shù)前生理鹽水灌腸1次，術(shù)中放置腹腔引流管，術(shù)后生理鹽水灌胃1次，術(shù)后禁食6h作為常規(guī)外科操作手段，比較研究FTS在膽汁淤積性黃疸大鼠肝臟缺血再灌注損傷中的干預(yù)作用，選取四君子湯作為獨(dú)立干預(yù)因子。結(jié)果顯示，各組間大鼠血清ALT、AST水平相互比較，假手術(shù)組與FTS+中藥組、FTS常規(guī)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；非 FTS組 AST、ALT 明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05）；非 FTS組 AST、ALT 明顯低于FTS+中藥組及 FTS 常規(guī)組（P＜0.05）；FTS+中藥組AST、ALT 明顯高于 FTS常規(guī)組（P＜0.05）。在肝臟細(xì)胞形態(tài)方面，F(xiàn)TS組肝細(xì)胞變性壞死情況好于非FTS組，而在肝細(xì)胞凋亡方面，假手術(shù)組顯著低于其他各組（P＜0.01），非 FTS組高于兩 FTS組（P＜0.05），F(xiàn)TS+中藥組與FTS常規(guī)組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。由此初步推測(cè)，F(xiàn)TS的因素干預(yù)，可減少肝細(xì)胞凋亡，降低肝功能的損傷程度。

四君子湯由人參、白術(shù)、茯苓、甘草四藥組成，功效健脾益氣，主治脾胃氣虛之證，該方用于外科手術(shù)患者術(shù)后元?dú)獯髠?，正氣不固，可以固正抗邪，降低術(shù)后創(chuàng)傷，促進(jìn)患者術(shù)后康復(fù)。

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