1型糖尿病大鼠認(rèn)知功能和細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)改變實(shí)驗(yàn)研究

阮麗麗 杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 杭州 310003

糖尿病性腦病變是糖尿病常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙、認(rèn)知力減弱、智力降低、情感障礙等。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用鏈脲佐菌素（STZ）制備1型糖尿病模型大鼠，觀察糖尿病大鼠的認(rèn)知功能，以及大鼠海馬組織細(xì)胞色素C（Cyt-c）蛋白表達(dá)的改變，探討糖尿病對(duì)認(rèn)知功能的影響及其機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 SD雄性大鼠20只，體質(zhì)量140～180g，SPF級(jí)，由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（SCXK[浙]2003—0001）。

1.2 主要儀器 One-Touch-Ⅱ型快速血糖儀及血糖試紙（美國(guó)強(qiáng)生公司）；Morris水迷宮及分析軟件（浙江大學(xué)藥學(xué)院藥物研究所）；WFZ800-3型紫外可見(jiàn)單光束分光光度計(jì)（北京瑞利光學(xué)儀器廠）；分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司產(chǎn)品）；電泳儀（BIORAD，Power PAC200）；電泳濕轉(zhuǎn)儀（BIO-RAD，Trans-Blot SD）。

1.3 主要試劑 鏈脲佐菌素（STZ）、Cyt-c及GAPDH抗體（Santa Cruz公司）；山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物試劑公司）；Western blotting相關(guān)試劑（碧云天生物技術(shù)研究所）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型建立 20只大鼠用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為正常組、實(shí)驗(yàn)組各10只。兩組大鼠均予標(biāo)準(zhǔn)鼠食飼養(yǎng)，并給飲5%葡萄糖溶液。實(shí)驗(yàn)組大鼠禁食24h，按60mg/kg腹腔注射鏈脲霉素（pH 4.4檸檬酸緩沖液配制，置于冰浴備用）。第4天尾部采血以O(shè)ne-Touch-Ⅱ型快速血糖測(cè)定儀測(cè)每只大鼠空腹血糖，血糖＞15mmol/L大鼠為造模成功。30天后，進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)定，處死后取大腦海馬組織進(jìn)行細(xì)胞色素C蛋白測(cè)定。

2.2 Morris水迷宮測(cè)定方法 主要由圓形水池和自動(dòng)攝象及電腦分析系統(tǒng)組成。水池上方的攝像機(jī)同步記錄大鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡。測(cè)試前將水注入池中，水深30cm（即水面高出站臺(tái)表面1cm，使大鼠不能見(jiàn)到站臺(tái)），放入碳素墨水使之成為黑色，水溫22～25℃。實(shí)驗(yàn)時(shí)要求各種實(shí)驗(yàn)條件保持不變。每只動(dòng)物第1天訓(xùn)練2次，使之學(xué)習(xí)并產(chǎn)生記憶，入池位置為站臺(tái)的對(duì)象限及鄰象限，于象限邊1/2弧度處將動(dòng)物頭朝池壁入水，120s未找到站臺(tái)者，將其引至站臺(tái)，放置30s引導(dǎo)其學(xué)習(xí)與記憶。試驗(yàn)共進(jìn)行5天，前4天為訓(xùn)練時(shí)間，第5天測(cè)試。數(shù)據(jù)采集及圖像分析均由圖像自動(dòng)監(jiān)視和處理系統(tǒng)完成。觀察指標(biāo)：觀察120s內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間（潛伏期）；搜尋平臺(tái)的策略（直線式，記分4分；趨向式，記分3分；隨機(jī)式，記分2分；圓圈式，記分1分）。

2.3 大鼠海馬組織細(xì)胞色素C（Cyt-c）蛋白測(cè)定 取單側(cè)海馬組織200mg加入含蛋白酶抑制劑的PBS緩沖液，4℃勻漿后10000g離心15min，上清蛋白定量后，取50μg蛋白，變性，行聚丙酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，6%脫脂奶粉室溫封閉1h，4℃過(guò)夜，洗滌后膜和兔抗鼠 Cyt-c抗體（1∶1 000）作用，4℃過(guò)夜，洗滌后加入辣根過(guò)氧化酶結(jié)合的抗兔IgG（1∶5 000），化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)，X線片顯影；將目的蛋白發(fā)光后的NC膜用strip液將一抗洗脫，結(jié)合內(nèi)參GAPDH（1∶2 000），余步驟同前。定量分析采用分子生物學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各目的條帶積分灰度值，所測(cè)結(jié)果為目的條帶除以內(nèi)參條帶灰度值的比值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，計(jì)量資料先行方差齊性檢驗(yàn)。方差齊性采用LSD-t檢驗(yàn)；若方差不齊，則采用Tamhane’St檢驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 Morris水迷宮潛伏期與搜索策略檢測(cè)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)第5天，實(shí)驗(yàn)組大鼠潛伏期比正常組明顯延長(zhǎng)（P＜0.01），搜索策略明顯劣于正常組（P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 兩組Morris水迷宮第5天潛伏期和搜尋平臺(tái)策略結(jié)果比較

3.2 大腦海馬組織Cyt-c蛋白表達(dá) Western blotting結(jié)果顯示，正常組Cyt-c蛋白表達(dá)量0.65±0.21，實(shí)驗(yàn)組為 1.13±0.42，實(shí)驗(yàn)組較正常組明顯升高（P＜0.05）。

4 討論

有研究表明，糖尿病與認(rèn)識(shí)功能障礙有密切聯(lián)系[1]，糖尿病腦病患者主要表現(xiàn)輕、中度認(rèn)知功能障礙。由于這些表現(xiàn)并不十分嚴(yán)重或缺乏對(duì)這方面的了解而常被忽視。對(duì)動(dòng)物的認(rèn)知過(guò)程一般從行為學(xué)、電生理、腦成像、組織化學(xué)及分子生物學(xué)等方面進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)采用的Morris水迷宮就是一種分析行為學(xué)方法。正常動(dòng)物在經(jīng)過(guò)3～4個(gè)實(shí)驗(yàn)日訓(xùn)練后，很快就學(xué)會(huì)以最快、最佳的速度和策略搜索到站臺(tái)確切位置；如果破壞海馬系統(tǒng)，可使動(dòng)物的反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，搜索目標(biāo)的軌跡混亂，由此可檢驗(yàn)?zāi)X的某結(jié)構(gòu)對(duì)空間認(rèn)知的影響[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組比較，糖尿病大鼠潛伏期明顯延長(zhǎng)、搜索策略明顯變差，說(shuō)明糖尿病大鼠存在著空間學(xué)習(xí)記憶障礙，提示該認(rèn)知功能障礙可能與海馬功能受損有關(guān)。

Christelle等[3]報(bào)道糖尿病是引起Alzheimer病（AD）的一個(gè)高危因素。神經(jīng)元細(xì)胞的死亡是AD的一個(gè)特征，而細(xì)胞的死亡與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。糖尿病時(shí)細(xì)胞凋亡增加可能與糖尿病引起的高血糖有關(guān)[4]。Brownlee等[5]提出，高血糖引起線粒體中超氧陰離子生成過(guò)多，導(dǎo)致組織細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，使機(jī)體處于易損狀態(tài)，線粒體膜通透性發(fā)生改變。Cyt-c是線粒體呼吸鏈中傳遞電子的載體，由核基因編碼的多肽和線粒體編碼的亞鐵血紅素組成，松散地結(jié)合在富含不飽和脂肪酸的線粒體內(nèi)膜外側(cè)心磷脂上，不能自由通過(guò)線粒體外膜。目前，Cyt-c促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用正逐步闡明[6]，當(dāng)?shù)蛲龃碳ひ蜃右鹁€粒體膜通透性發(fā)生改變，Cyt-c從間隙釋放到胞漿后，首先與胞漿中的凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）結(jié)合，聚合成為復(fù)合體，繼而啟動(dòng)caspase-9形成全酶，然后裂解，最后導(dǎo)致caspase-9前體自動(dòng)活化，活化的caspase-9分裂，繼續(xù)激活下游的capases成員，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[7-8]。壞死和凋亡雖然為細(xì)胞死亡的兩種方式，但兩者發(fā)生過(guò)程中的某些環(huán)節(jié)可能重疊，如線粒體膜通透性的改變[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常大鼠海馬組織中Cyt-c表達(dá)很少，糖尿病大鼠Cyt-c表達(dá)明顯增多。我們認(rèn)為，造模后，高血糖引起線粒體膜通透性發(fā)生改變，釋放出Cyt-c并結(jié)合至核膜，誘導(dǎo)DNA裂解，進(jìn)入非caspase依賴性細(xì)胞凋亡過(guò)程[10]；Cyt-c同時(shí)也對(duì)下游caspase進(jìn)行活化，進(jìn)入caspase依賴性細(xì)胞凋亡過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11]。以上過(guò)程導(dǎo)致糖尿病大鼠海馬組織中Cyt-c表達(dá)較正常大鼠明顯增加，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，糖尿病時(shí)高血糖引起海馬組織Cyt-c表達(dá)增加，從而導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡增加，進(jìn)而導(dǎo)致海馬功能受損，引起認(rèn)知障礙。

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