HPLC 法同時測定茵苓祛濕湯中綠原酸、梔子苷的含量

唐年忠，吳生齊，楊立偉（.廣東省食品藥品監(jiān)督管理局審評認證中心，廣州市50080；.廣東省藥品檢驗所，廣州市 5080）

茵苓祛濕湯為由金銀花、茵陳、茯苓、梔子、布渣葉、木棉花、甘草、神曲等13味藥材組成的臨床驗方，功效為祛濕化濁、清熱消滯，臨床主要用于氣滯郁濕所致之濕熱證。綠原酸為方中主藥金銀花與茵陳的指標(biāo)性成分，具有抗病毒、抗菌消炎、清除自由基、降糖、降脂、保肝利膽等多種功效[1]。梔子中含有環(huán)烯醚萜苷類有效成分，包括梔子苷、京尼平苷、羥異梔子苷、梔子苷酸等，其中含量最高的是梔子苷和京尼平苷[2]，具有解熱鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜催眠、保肝利膽、抗炎殺菌、降壓、防動脈粥樣硬化、抗血栓、免疫抑制等作用[3]。本試驗采用高效液相色譜（HPLC）法測定茵苓祛濕湯中綠原酸、梔子苷的含量[4，5]，以為該方劑的新藥開發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

HPLC儀，含SIL-20A自動進樣器、LC-20AT四元梯度泵、SPD-20A紫外檢測器、LC solution化學(xué)工作站（日本島津公司）。

綠原酸、梔子苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為110753-200413、0749-200007）；乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純；茵苓祛濕湯（為擬開發(fā)成醫(yī)院制劑的臨床煎劑，批號：090203、090204、090205）；所用藥材均為市售品，均經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院張軍教授鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.4%磷酸（13∶87）；流速：1.0 mL·min-1；雙波長檢測：綠原酸327 nm、梔子苷238 nm；柱溫：室溫；進樣量：5μL。在上述色譜條件下，綠原酸、梔子苷分離度良好。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 混合對照品溶液的制備

取綠原酸、梔子苷對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含綠原酸0.08 mg、梔子苷0.18 mg的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液及陰性對照溶液的制備

按處方比例稱取金銀花、茵陳、茯苓、梔子、布渣葉、木棉花、甘草、神曲等13味藥材共63.5 g，加水煎煮2次（10、8倍量），每次1 h。濾過，合并藥液，測定體積。精密量取相當(dāng)于1.00 g生藥的提取液，置25 mL棕色容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，以0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

另按處方比例，分別同法制備缺金銀花、茵陳陰性對照溶液與缺梔子陰性對照溶液。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取上述混合對照品溶液2、4、8、12、16 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。分別以綠原酸、梔子苷的進樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得綠原酸、梔子苷的回歸方程分別為Y＝2.69×106X+8 521（r＝0.999 7，n＝5）、Y＝1.47×106X－13 294（r＝0.999 9，n＝5）。結(jié)果表明，綠原酸、梔子苷的進樣量分別在0.154 4～1.235 2、0.363 2～2.905 6 μg范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

精密吸取上述混合對照品溶液10μL，連續(xù)進樣6次，測定峰面積。結(jié)果，綠原酸的平均峰面積積分值為2 076 095，RSD＝1.3%（n＝6）；梔子苷的平均峰面積積分值為2 655 204，RSD＝1.2%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液適量，分別于0、2、4、8、12 h進樣，測定峰面積。結(jié)果，綠原酸的平均峰面積積分值為1 490 425，RSD＝1.7%（n＝5）；梔子苷的平均峰面積積分值為764 697，RSD＝1.6%（n＝5），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一茵苓祛濕湯藥液適量，共6份，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣測定。結(jié)果，綠原酸的平均含量為2.756 mg·g-1，RSD＝1.9%（n＝6）；梔子苷的平均含量為2.647 mg·g-1，RSD＝1.9%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的茵苓祛濕湯藥液適量，共6份。分別精密量取相當(dāng)于0.50 g生藥量的藥液，精密加入綠原酸、梔子苷對照品適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定樣品含量并計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 1Results of recovery tests（n＝6）

2.9 樣品含量測定

按處方比例稱取茵苓祛濕湯各藥材，共3份，分別按“2.3”項下方法制備煎劑及供試品溶液。精密吸取5μL供試品溶液注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定樣品中綠原酸與梔子苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of content determination（n＝3）

3 討論

在上述色譜條件下，金銀花、茵陳雙陰性對照圖譜中，在綠原酸色譜峰處有一小峰干擾。經(jīng)計算，該干擾峰的峰面積為供試品溶液中綠原酸峰面積的1.8%，＜5.0%，故干擾可忽略。

本試驗采用HPLC法同時測定茵苓祛濕湯中有效成分綠原酸、梔子苷的含量，分離效果與重復(fù)性好、簡便、快捷。該煎劑中有效成分的含量及日服用量可為該制劑及類似方劑的新藥研究提供借鑒。

[1] 陳紹華，王亞琴，羅立新.天然產(chǎn)物綠原酸的研究進展[J].食品科技，2008，33（2）：195.

[2] 倪慧艷，張朝暉，傅海珍.中藥梔子的研究與開發(fā)概述[J].中國中藥雜志，2006，31（7）：538.

[3] 劉曉棠，趙伯濤，張 玖，等.梔子的綜合開發(fā)與利用[J].中國野生植物資源，2008，27（1）：19.

[4] 孫文武.HPLC法測定梔柏合劑中梔子苷的含量[J].中國藥房，2007，18（33）：2 610.

[5] 江 帆，郭培果.HPLC法測定兒感口服液中綠原酸的含量[J].中國藥房，2009，20（33）：2 600.