紅花藥材黃色素類成分的HPLC指紋圖譜研究Δ

李雪瑩，武永剛（山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，煙臺市 264100）

紅花為菊科植物紅花Carthamus tinctoriusL.的管狀花，為活血化瘀的主要中藥之一，用于治療冠心病、腦血栓等心腦血管疾病[1]。目前對紅花有效部位的研究主要集中在查爾酮類化合物紅花黃色素（safflower yellow，SY）上。SY是一種復(fù)雜的水溶性混合物，在干花中含量占20%～30%，目前報道的SY類成分中主要有羥基SYA、SYB、SYC、SYA、Safflomin A、Safflomin B、Safflomin C、tinctorimine、precarthamin等，紅花的活血化瘀等功能多與這一類化合物有關(guān)[2]。筆者通過反相高效液相色譜（RP-HPLC）法建立了紅花藥材中SY類成分的指紋圖譜分析方法，以期為紅花的鑒別和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1100型HPLC儀，包括四元梯度泵、DAD紫外檢測器（美國Agilent公司）。

乙腈（色譜純，德國Merck公司）；三氟乙酸（分析純，南開大學(xué)精細(xì)化學(xué)實(shí)驗(yàn)廠）；甲醇（色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司，使用前經(jīng)0.45 μm水系濾膜過濾）；羥基SYA對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：111637-200301）；紅花為菊科植物紅花C.tinctoriusL.的干燥花瓣，由本校張欽德教授鑒定為真品，其商品藥材編號S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10分別來源于四川、江蘇、遼寧、黑龍江、山東、吉林、內(nèi)蒙古、北京、河南、新疆。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：25℃；流速：1.0 mL·min-1；流動相：乙腈（A）-0.01%三氟乙酸溶液（B），梯度洗脫（0～25 min，2%～10%A；25～35 min，10%～15%A；35～65 min，15%～25%A；65～70 min，25%A）；分析時間：70 min；檢測波長：403 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 供試品溶液的制備

稱取紅花藥材粉末5 g，加12倍量水浸泡30 min，于60℃下溫浸1 h，濾過；濾渣再加10倍量水，繼續(xù)溫浸1 h，濾過，合并濾液減壓濃縮至提取液含生藥1 g·mL-1。加入95%乙醇使含醇量達(dá)到80%，醇沉24 h，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取羥基SYA對照品適量，置50 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，制成含羥基SYA0.6 mg·mL-1的對照品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液（編號：S10）適量，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，各共有峰的相對保留時間和相對峰面積基本沒有明顯變化，RSD均＜3%，表明方法精密度良好，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液（編號：S10）適量，分別在配制后0、3、6、9、12和24 h進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，各共有峰相對保留時間的RSD均＜0.36%，相對峰面積的RSD均＜2.53%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批（編號：S10）紅花藥材適量，共6份，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，各色譜峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均＜3%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)研究

2.5.1 HPLC指紋圖譜分析 取S1～S10號紅花藥材樣品粉末各適量，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各取20 μL進(jìn)樣，得到各樣品的指紋圖譜。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）”進(jìn)行色譜峰的匹配和相似度的計算，將10批次樣品圖譜導(dǎo)入相似度軟件，以S10號樣品色譜為參照，采用平均計算法，由10批紅花藥材提取物指紋圖譜生成對照指紋圖譜（見圖1）。以對照指紋圖譜為參照，各批樣品指紋圖譜（見圖2）與之進(jìn)行比較，計算得各批樣品指紋圖譜相似度值，S1～S10號相似度分別為0.996、0.998、0.995、0.998、0.969、0.995、0.999、0.996、0.999、0.999。所測樣品的相似度均在0.9以上，顯示10批樣品與對照指紋圖譜有較高的相似性。

圖1 紅花藥材中SY類成分對照指紋圖譜（共有模式）Fig 1 Fingerprints of SY from C.tinctorius（common model）

圖2 10批次樣品的HPLC指紋圖譜Fig 2 HPLC fingerprints of 10 batches of samples

由圖2可知，所建立的指紋圖譜包含8個主要共有峰，占總峰面積的90%以上。再通過圖1可確定3號峰為羥基SYA，含量達(dá)到了50%以上，峰面積最大，出峰時間適中，與相鄰色譜峰分離良好，被選作參照峰；4號峰表現(xiàn)為多個小峰組成的寬峰，峰形常有變化；7、8號峰未完全分開；其他峰分離較好。2.5.2 不同產(chǎn)地藥材指紋圖譜比較 相對保留值系統(tǒng)將波動較大的絕對值變?yōu)榉€(wěn)定性較好的相對保留值，將整個比較系統(tǒng)處于同一尺度范圍內(nèi)進(jìn)行比較，提高了樣品間的可比性和比較結(jié)果的可信性。以圖1中3號峰為參照峰，計算各樣品指紋圖譜中各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。從10個樣品指紋圖譜分析結(jié)果可知，8個共有峰相對保留時間一致，但不同樣品相對峰面積的比值相差較大。紅花藥材中SY類成分共有峰的相對保留時間和相對峰面積分別見表1和表2。

表1 紅花藥材中SY類成分共有峰的相對保留時間Tab 1 Relative retention time of common peaks of SY from C.tinctorius

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

本試驗(yàn)采用RP-HPLC法作為測定紅花藥材中SY類成分指紋圖譜的方法，重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度均較高。由于SY類成分復(fù)雜，單一流動相無法達(dá)到很好的分離效果，故采用梯度洗脫方式；黃酮類成分含有多個酚羥基，呈弱酸性，故使用酸性緩沖系統(tǒng)；參考相關(guān)文獻(xiàn)[3]，對不同組成的流動相系統(tǒng)進(jìn)行了梯度洗脫試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用乙腈時，基線漂移現(xiàn)象較甲醇輕；對流動相中酸的考察包括：甲酸、乙酸、磷酸、三氟乙酸，結(jié)果顯示使用三氟乙酸能更好地改善峰形和分離度。在整個分析時間段（70 min）內(nèi)，各色譜峰達(dá)到很好的分離效果且相對保留時間穩(wěn)定，有利于指紋圖譜的分析。

在波長為403 nm時，SY類化合物有最大吸收[4]，所得色譜峰總峰面積較大、分離度較好，故選取403 nm作為檢測波長。

表2 紅花藥材中SY類成分共有峰的相對峰面積Tab 2 Relative peak areas of common peaks of SY from C.tinctorius

3.2 提取條件的選擇

提取工藝是影響指紋圖譜、反映藥材內(nèi)在化學(xué)成分的重要因素之一。本試驗(yàn)以總黃色素和羥基SYA的含量為考察指標(biāo)進(jìn)行提取溶劑和提取方法的選擇。為了使SY類成分提取完全，根據(jù)紅花所含成分的性質(zhì)，采用不同極性的溶劑（純水和不同濃度的乙醇）和不同的提取方式（溫浸、超聲和回流）進(jìn)行提取[5]，并對提取時間進(jìn)行了單因素試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著乙醇濃度的增加，SY在提取液中的質(zhì)量濃度反而降低，且乙醇提取帶進(jìn)的脂溶性雜質(zhì)較多，因此選擇以水作為提取溶劑、60℃下溫浸為SY的最佳提取方法；單次提取時間應(yīng)控制在1 h以內(nèi)；采取醇沉法以除去水提液中蛋白質(zhì)、多糖等影響測定的干擾性成分，效果較好。

3.3 不同產(chǎn)地藥材指紋圖譜相似度評價

由本試驗(yàn)結(jié)果可得，10批不同產(chǎn)地來源的紅花藥材SY類成分的指紋圖譜面貌基本一致，相似度良好（r＞0.90），說明不同產(chǎn)地紅花藥材的SY類成分化學(xué)組成一致性較好，質(zhì)量穩(wěn)定，可以用來作定性鑒別。但各組分相對含量仍有一定的差異，其中變化較大的為來自于山東的紅花藥材SY類成分指紋圖譜（對應(yīng)于表2中S5號數(shù)據(jù)），可以看出差異主要集中在4號和8號峰的峰形及其相對保留值上。

3.4 小結(jié)

本方法穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好，可為SY類成分的品質(zhì)評價和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。SY是一種復(fù)雜的水溶性混合物，由于對水溶性部位的成分研究有一定的難度，加之其成分有些不穩(wěn)定，較難獲得單體化合物，故本試驗(yàn)只指認(rèn)了羥基SYA的色譜峰，其他峰有待進(jìn)一步研究確定其歸屬；同時，如果將藥理數(shù)據(jù)與指紋圖譜數(shù)據(jù)相結(jié)合，建立譜效關(guān)聯(lián)，可進(jìn)一步優(yōu)化指紋圖譜，提高紅花質(zhì)量控制的針對性。

[1] 廖 暉，郝一彬.紅花注射液對急性心肌缺血大鼠的保護(hù)作用及機(jī)理探討[J].中國藥房，2003，14（5）：269.

[2] 姜建雙.紅花化學(xué)成分及生物活性研究[D].北京：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2008.

[3] Fan L，Zhao HY，Xu M，et al.Qualitative evaluation and quantitative determination of 10 major active components inCarthamus tinctoriusL.by high-performance liquid chromatography coupled with diode array detector[J].J Chromatogr A，2009，1 216（11）：2 063.

[4] 高梓真，夏小艷，黃秋月，等.超聲法提取紅花中紅花黃色素的工藝研究[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2008，42（6）：560.

[5] 周平蘭，夏新華.紅花黃色素提取工藝的研究[J].湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004，24（1）：11.