微乳液相色譜法同時(shí)測定大黃中5種蒽醌類衍生物的含量Δ

何素珍，張忠義，張守堯（南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院藥劑科，廣州市510282）

大黃為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatumL.、唐古特大黃R.tanguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃R.officinaleBaill.的干燥根及根莖，具有瀉下、通瘀導(dǎo)滯、抗菌消炎、止痛止血、抗腫瘤、抗氧化和降血脂等作用[1]，并應(yīng)用于臨床多種危重急癥的搶救治療[2]。大黃的主要有效成分為蒽醌類衍生物，包括蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚以及與葡萄糖結(jié)合成的苷[3]。微乳液相色譜（MELC）法是一項(xiàng)液相色譜新技術(shù)[4]，它不僅存在常規(guī)色譜的分離機(jī)制，還存在微乳液滴內(nèi)外相之間的分配[5]。其與常規(guī)高效液相色譜（HPLC）法相比，具有分離效率高和分離速度快的優(yōu)越性，可用于復(fù)雜樣品的分離；血清、尿液經(jīng)過簡單的稀釋后便可以直接進(jìn)樣分析，無需預(yù)處理；在梯度洗脫和低紫外波長（190 nm）檢測方面也有一定的優(yōu)勢[6～10]。對于MELC法的應(yīng)用，主要涉及化學(xué)藥品中多種成分、藥物制劑以及生物樣品的分析[11，12]，而用于中藥成分的分析較少。筆者采用MELC法同時(shí)測定了大黃中5種蒽醌類衍生物的含量，方法簡便、準(zhǔn)確、可靠，取得了滿意結(jié)果。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型HPLC儀，配二極管陣列檢測器及化學(xué)工作站（美國安捷倫科技有限公司）；KQ-600DE型數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率：600 W，工作頻率：40 kHz）。

蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品和掌葉大黃、唐古特大黃藥材（中國藥品生物制品檢定所，批號 分 別 為 110795-200504、110757-200206、110756-200110、110796-200513、 110758-200610、 121249-200402、 120902-200609）；藥用大黃（購于廣州市藥材公司，經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院藥劑科周本杰主任藥師鑒定為真品）；十二烷基硫酸鈉（SDS，化學(xué)純，西隴化工股份有限公司，批號：0911191）；甲醇、乙腈（色譜純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；水為注射用水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液 取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對照品各適量，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加適量甲醇超聲溶解，再加甲醇至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。臨用前用0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液進(jìn)樣。

2.1.2 供試品溶液 取干燥后的各大黃藥材粉末（過四號篩）約0.3 g，精密稱定，置具塞燒瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5 mL，置燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液10 mL，超聲使溶解，再加氯仿10 mL，加熱回流1 h，放冷，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用少量氯仿分次洗滌燒瓶，洗液并入分液漏斗中，分取氯仿層，酸液再用氯仿提取3次，每次10 mL，合并氯仿液，揮去溶劑，殘?jiān)由倭考状际谷芙?，定量轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。臨用前用0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液進(jìn)樣。

2.2 微乳流動(dòng)相的制備

將SDS、正丁醇、正辛烷及含0.5%三乙胺的水溶液按順序混合，超聲15 min，即得透明穩(wěn)定的微乳，用磷酸調(diào)pH值至3.0，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，備用。

2.3 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1 mL·min-1；柱溫：28 ℃；檢測波長：254 nm；流動(dòng)相：2.5%（W/V）SDS-0.1%（V/V）正辛烷-8.0%（V/V）正丁醇-0.5%（V/V）三乙胺（磷酸調(diào)pH值至3.0）；進(jìn)樣量：15 μL。色譜見圖1。

圖1 微乳液相色譜圖Fig 1 Microemulsion liquid chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.1.1”項(xiàng)下混合對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置6個(gè)10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，取15 μL進(jìn)樣測定，每個(gè)混合對照品溶液進(jìn)樣3次。分別以濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的平均峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得出大黃中5種蒽醌類衍生物的回歸方程，詳見表1。

表1 5種蒽醌類衍生物對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab 1 Standard curves of 5 anthraquinone derivatives

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.4”項(xiàng)下蘆薈大黃素濃度分別為18.8、37.6 μg·mL-1的混合對照品溶液適量，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果，各化合物峰面積的RSD（n＝6）分別為蘆薈大黃素0.49%、0.91%，大黃酸0.48%、0.72%，大黃素0.69%、0.78%，大黃酚0.86%、0.94%，大黃素甲醚1.29%、1.22%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.4”項(xiàng)下蘆薈大黃素濃度為28.2 μg·mL-1的混合對照品溶液適量，室溫避光，每隔1 h進(jìn)樣一次，重復(fù)7次。結(jié)果，各化合物峰面積的RSD（n＝7）分別為蘆薈大黃素0.28%、大黃酸0.57%、大黃素0.58%、大黃酚0.38%、大黃素甲醚1.23%，表明大黃中5種蒽醌類衍生物在7 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品適量，共6份，精密稱定，精密加入一定量的混合對照品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 5種蒽醌類衍生物的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 2Results of recovery tests for 5 anthraquinone（n＝6）

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批大黃藥材粉末（過四號篩）6份，各約0.3 g，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，各化合物平均含量的RSD（n＝6）分別為蘆薈大黃素0.38%、大黃酸0.52%、大黃素0.85%、大黃酚1.03%、大黃素甲醚0.48%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 樣品含量測定

取3種大黃藥材粉末（過四號篩）各約0.3 g，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算大黃中5種蒽醌類衍生物的含量，結(jié)果見表3。

表3 MELC法測定3種大黃中5種蒽醌類衍生物的含量結(jié)果（mg·g-1）Tab 3 Results of content determination of 5 anthraquinone in 3 kinds of Rhei Radix Et Rhizoma by MELC（mg·g-1）

3 討論

3.1 表面活性劑濃度對分離的影響

在微乳穩(wěn)定區(qū)域范圍內(nèi)，考察SDS濃度在20.0～35.0 g·L-1范圍變化時(shí)的試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)隨著SDS濃度增加，蘆薈大黃素與大黃酸的分離度降低，保留時(shí)間相應(yīng)縮短；當(dāng)SDS濃度在25.0 g·L-1時(shí)，分離效果和保留時(shí)間最為理想，故確定表面活性劑SDS的試驗(yàn)濃度為25.0 g·L-1。

3.2 助表面活性劑含量對分離的影響

改變助表面活性劑正丁醇的含量，對保留時(shí)間和分離效果有影響。筆者考察了正丁醇含量在4.0%～15.0%范圍變化時(shí)的試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)隨著正丁醇含量的增加，保留時(shí)間相應(yīng)縮短。綜合考慮組分分離度和保留時(shí)間，確定助表面活性劑正丁醇的濃度為8.0%。

3.3 油相含量對分離的影響

改變油相正辛烷的含量，可以改變物質(zhì)的保留時(shí)間和分離度。筆者考察了正辛烷含量在0.1%～1.4%范圍變化時(shí)對分離效果的影響，發(fā)現(xiàn)隨著正辛烷含量的降低，蘆薈大黃素與大黃酸、大黃酚與大黃素甲醚的分離度相應(yīng)提高，保留時(shí)間相應(yīng)延長；當(dāng)正辛烷的含量為0.1%時(shí)，分離效果最理想，故確定油相正辛烷的含量為0.1%。

3.4 pH值對分離的影響

在微乳體系中，用磷酸調(diào)流動(dòng)相pH值在2.5～7.0范圍，考察試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)改變pH值主要是影響蘆薈大黃素的保留時(shí)間，隨著pH值的增加，蘆薈大黃素的保留時(shí)間相應(yīng)縮短；當(dāng)pH值為3.0時(shí)，效果最為理想，故選擇流動(dòng)相pH值為3.0。

3.5 添加劑對分離的影響

采用SDS-正辛烷-正丁醇-0.5%三乙胺微乳流動(dòng)相，分別添加有機(jī)溶劑，使成微乳-甲醇（95∶5，V/V）、微乳-乙腈（95∶5，V/V）流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果顯示，加入有機(jī)添加劑后，對組分分離度無影響，但保留時(shí)間延長。

本試驗(yàn)建立了同時(shí)測定大黃藥材中5種蒽醌類衍生物含量的微乳液相色譜法。結(jié)果表明，5種蒽醌類衍生物達(dá)到基線分離，精密度在0.48%～1.29%之間，準(zhǔn)確度高；加樣回收率在97.53%～101.37%之間；具有較寬線性范圍和良好的線性關(guān)系（r在0.998 7～0.999 9之間）。同時(shí)也表明，采用微乳流動(dòng)相同樣可以分離成分復(fù)雜、性質(zhì)相近的中藥里的多種成分，而且有機(jī)溶劑用量少、毒性低、相對的費(fèi)用和污染較少，可成為中藥質(zhì)量控制方法的新選擇。

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