注射用肌萎靈細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的研究Δ

鄭亞杰，賈繼明，王貴金，劉興國(guó)，蔡艷，宋劍（河北以嶺醫(yī)藥研究院，石家莊市050035）

注射用肌萎靈是由人參、淫羊藿藥材經(jīng)加工制備而成的中藥注射用無(wú)菌粉末制劑，具有治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾?。∥s側(cè)索硬化、進(jìn)行性脊肌萎縮、進(jìn)行性延髓麻痹、原發(fā)性側(cè)索硬化）、進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良、先天性肌病等疾病所致的肌肉萎縮及重癥肌無(wú)力的作用[1]。注射用肌萎靈質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)注射劑采用家兔法進(jìn)行熱原檢查，但家兔法進(jìn)行熱原檢查操作復(fù)雜、時(shí)間長(zhǎng)。根據(jù)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法（鱟試劑，TAL）具有靈敏度高、快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[2，3]，按《中國(guó)藥典》“中藥注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則”及“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”[4]，筆者建立了注射用肌萎靈細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法，以確保臨床用藥安全。

1 儀器與試藥

XW-01定時(shí)可調(diào)速旋渦混勻器（上海醫(yī)大儀器廠）；YJ-875B垂直凈化工作臺(tái)（上海陽(yáng)光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；DK-S26電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

注射用肌萎靈（本院自制，規(guī)格：每支820 mg，批號(hào)：jwl090203、jwl090301、jwl090302）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CES，效價(jià)為每支10 EU，批號(hào)：090301）、TAL（靈敏度0.25 EU·mL-1，批號(hào)：080506）、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（WBET，規(guī)格：每支10 mL，批號(hào)：080301，內(nèi)毒素含量＜0.015 EU·mL-1）均購(gòu)于廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司；TAL（靈敏度0.25 EU·mL-1，批號(hào)：08120912，福州新北生化工業(yè)有限公司；靈敏度0.25 EU·mL-1，批號(hào)：0902250，湛江博康海洋生物有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 內(nèi)毒素限值（L）的確定

根據(jù)公式L＝K/M（式中K為按規(guī)定的給藥途徑，人每千克體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑K＝5 EU·kg-1·h-1；M為人用每千克體重每小時(shí)的最大供試品劑量，人均按60 kg計(jì)算），根據(jù)使用說(shuō)明書，本品成人日用量為2支（每支820 mg，溶解于250 mL注射用溶媒中），注射時(shí)間為2 h。因此，M＝（2×820）/（60×2）＝41/3≈13.7 mg·kg-1·h-1，則L＝5/13.7＝0.366 EU·mg-1。

2.2 TAL靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

將CSE用WBET溶解后，于旋渦混合器上混合15 min，然后制成濃度為0.5、0.25、0.125、0.0626 EU·mL-1的稀釋液，按照2010年版《中國(guó)藥典》項(xiàng)下[4]試驗(yàn)進(jìn)行（λ為TAL的標(biāo)示靈敏度，為0.25 EU·mL-1），結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 TAL靈敏度復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Verification results of the sensitivity of TAL

由表1可知，3個(gè)廠家的3批TAL經(jīng)CSE檢查，其靈敏度的測(cè)定值（λc）均位于0.5 λ～2 λ范圍內(nèi)，均符合規(guī)定，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

2.3 樣品最小有效稀釋濃度（c）的確定

根據(jù)最大有效稀釋倍數(shù)公式MVD＝cL/λ。本品為注射用無(wú)菌粉末，MVD＝1，則c＝λ/L。本試驗(yàn)中L為 0.366 EU·mg-1。因此，本試驗(yàn)中c＝λ/L＝0.25/0.366＝0.68 mg·mL-1。

2.4 干擾預(yù)試驗(yàn)

將供試品初始溶液（820 mg/6 mL≈137 mg·mL-1，相當(dāng)于c為0.68 mg·mL-1的約200倍），用WBET分別稀釋2、40、80、120、160、200倍，使?jié)舛燃s為67、3.3、1.7、1.1、0.8、0.7 mg·mL-1的溶液，每一個(gè)稀釋倍數(shù)做2支供試品管（NPC）和2支供試品2λ濃度的CSE供試品陽(yáng)性對(duì)照管（PPC）；另取2支CSE加WBET制成2λ的溶液作為陽(yáng)性對(duì)照管（PC），2支TAL加WBET作為陰性對(duì)照管（NC）。按2010年版《中國(guó)藥典》（一部）項(xiàng)下[4]進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 TAL的干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of the preliminary interference test of TAL

由表2可知，樣品在上述試驗(yàn)稀釋濃度對(duì)檢測(cè)均無(wú)干擾，故選擇供試品初始濃度稀釋40倍，經(jīng)干擾試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.5 干擾試驗(yàn)

用 WBET 將 3批供試品（jwl090203、jwl090301、jwl 090302）分別稀釋為初始濃度的40倍，作為供試品溶液（A）；取供試品稀釋液及WBET分別將CES稀釋為0.5、0.25、0.125、0.062 5 EU·mL-1的溶液作為干擾試驗(yàn)溶液（B）和陽(yáng)性對(duì)照溶液（C）；取WBET，作為陰性對(duì)照溶液（D）。照2010年版《中國(guó)藥典》（一部）項(xiàng)下[4]方法，取3個(gè)廠家的TAL進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，Es在0.5 λ～2.0 λ，且Et在0.5Es～2.0Es范圍內(nèi)，3個(gè)廠家的TAL試驗(yàn)結(jié)果基本一致，則供試品溶液在初始濃度稀釋40倍時(shí)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)不產(chǎn)生干擾。

2.6 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

取3批樣品用WBET稀釋至初始濃度的40倍，作為供試品溶液；取3個(gè)廠家靈敏度為0.25 EU·mL-1的TAL，按照2010年版《中國(guó)藥典》（一部）項(xiàng)下[4]進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果，3批樣品經(jīng)3個(gè)廠家TAL檢測(cè)均符合規(guī)定。TAL檢查結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

由于本品為注射用無(wú)菌粉末，溶解時(shí)本身會(huì)占用較大體積[5，6]，因此在試驗(yàn)過(guò)程中考慮到樣品本身溶解后體積，結(jié)合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢查項(xiàng)下試驗(yàn)，采用將樣品先用6 mLWBET溶解，再進(jìn)行稀釋，避免了由于樣品濃度不準(zhǔn)確導(dǎo)致對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的寬松判定可能造成的臨床使用不安全。

干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)考察的各稀釋濃度均無(wú)干擾。由于中藥注射劑成分較復(fù)雜，干擾因素較多，不同廠家不同批次的TAL亦存在一定差異，故在試驗(yàn)中選取相對(duì)較大的稀釋倍數(shù)（40倍），以確保供試品濃度不對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生干擾。

表3 TAL的干擾試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Results of the interference test of TAL

表4 TAL檢查結(jié)果Tab 4 Results of TALtest

經(jīng)過(guò)3個(gè)不同廠家的TAL檢測(cè)，3批制劑均符合規(guī)定，檢測(cè)結(jié)果與家兔法結(jié)果一致，表明TAL進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查可用于注射用肌萎靈的質(zhì)量控制。因其操作簡(jiǎn)單、靈敏快捷、準(zhǔn)確可靠，可以大大提高檢測(cè)效率，降低試驗(yàn)成本，值得在注射用肌萎靈批量生產(chǎn)檢測(cè)過(guò)程中推廣。

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