丹參和川芎嗪聯(lián)合應(yīng)用對大鼠腦缺血再灌注氧化損傷的保護作用研究

張莉，高志軍，趙靜（.西藏大學醫(yī)學院，拉薩市850000；.西藏當雄縣人民醫(yī)院，當雄縣85500）

腦缺血再灌注損傷（Cerebral ischemia reperfusion injury，CIR）是指腦組織缺血一定時間恢復(fù)血供后，腦功能不但未能恢復(fù)，反而出現(xiàn)了更加嚴重的腦機能障礙。它是由興奮性氨基酸中毒、氧化應(yīng)激、細胞內(nèi)鈣超載、炎癥反應(yīng)和細胞凋亡等多種因素參與的病理過程[1]，其中自由基連鎖反應(yīng)被認為是造成腦組織損害的重要機制。因此，清除自由基、切斷自由基對腦缺血的繼發(fā)性損害已成為目前神經(jīng)保護治療的重要途徑之一。近年研究表明，中藥對CIR后的腦細胞起著重要的保護作用。丹參為唇形科多年生草本植物，以根入藥，具有活血化瘀、寧心安神等功效?，F(xiàn)代藥理學研究表明[2～4]，丹參具有改善腦血流再灌注和腦血流自動調(diào)節(jié)機制，能清除自由基、抗生物膜過氧化、拮抗鈣離子、防止鈣超載。川芎嗪是川芎的一種生物堿，用于治療閉塞性血管疾病、心絞痛、冠心病、腦血栓形成等[5～7]。本研究在已證實單味中藥丹參、川芎嗪對CIR后對腦細胞有一定保護作用的基礎(chǔ)上，進一步研究兩藥聯(lián)合應(yīng)用是否比單用的效果更好，以為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

GGX25型原子吸收分光光度計（北京科創(chuàng)海光儀器有限公司）；721型分光光度計（南京第四分析儀器有限公司）。

1.2 試藥

川穹嗪注射液（北京第四科寶制藥有限公司，批號：100218；規(guī)格：40 mg·2 mL-1）；丹參注射液（上海中西制藥有限公司，批號：091124，規(guī)格：3 g·2 mL-1）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 動物

健康Wistar成年大鼠200只，♂，體重（270±18）g，由第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供（動物合格證號：24301050）。

2 方法

2.1 模型的復(fù)制

模型的復(fù)制方法參照文獻[8]，采用大腦中動脈線栓法（MCAO）制備大鼠右側(cè)大腦中動脈缺血2 h再灌注24 h模型。常規(guī)麻醉消毒，取頸旁右側(cè)切口，分離右側(cè)頸總動脈（CCA）、右頸外動脈（ECA）與頸內(nèi)動脈（ICA），順CCA經(jīng)ICA將栓線送至顱內(nèi)，遇阻力而止，栓線插入深度18～20 mm?？p合切口，留置線頭于體外。腦缺血2 h再灌注時，將大鼠再次麻醉，輕輕抽提栓線至CCA內(nèi)，使血流再通。假手術(shù)大鼠栓線只插入10 mm，其余步驟相同。復(fù)制模型成功的判定標準為大鼠清醒后出現(xiàn)右側(cè)Homer征及以左前肢為重的偏癱。

2.2 分組和給藥

實驗分為5組，即假手術(shù)（等滲鹽水1.5 mL）、模型（等滲鹽水1.5 mL）、丹參（2 g·kg-1）、川芎嗪（3.5 mg·kg-1）和丹參+川芎嗪（2 g·kg-1+3.5 mg·kg-1）組。分別于缺血后再灌注前20 min、再灌注后12、24 h大鼠尾靜脈緩慢推注給藥。

2.3 TTC染色測定各組大鼠腦梗死面積

大鼠于缺血2 h再灌24 h ig給藥后迅速斷頭取左側(cè)大腦，切去嗅球、小腦和低位腦干，間隔2 mm連續(xù)作6個腦冠狀切片，立即置切塊于37℃TTC染液（含3%TTC 4.0 mL，1 mol·L-1K2HPO40.1 mL）中避光恒溫孵育30 min，在15 min時將腦組織塊翻面，染色后用10%甲醛固定24 h。TTC被線粒體過氧化氫酶還原，可使正常組織染色呈紅色，壞死組織呈白色。數(shù)碼相機拍照，用形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)計算腦梗死區(qū)域占全腦總面積的百分比。公式如下：梗死面積百分比＝梗死面積/全腦總面積×100%。

2.4 腦組織水、鈣含量的測定

同上取右前腦50～100 mg，稱重后于105℃恒溫箱烘干至恒重，即為干重。用公式[（濕重－干重）/濕重]×100%計算腦含水量。將烘干的腦組織次氯酸消化，5%鹽酸定容，在原子吸收分光光度計上測吸光度（OD）值，以標準曲線法計算腦鈣含量。

2.5 腦組織SOD活性、MDA含量測定

將大鼠斷頭取腦，用去離子水沖凈表面，取視交叉和腳間窩間右腦扇形冠狀切片約50～100 mg，通過分光光度計測定SOD活性和MDA含量。

2.6 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠腦梗死面積的測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦梗死面積顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，各用藥組大鼠腦梗死面積顯著降低（P＜0.01），且丹參+川芎嗪組比單用藥組效果更好，表明兩藥聯(lián)合應(yīng)用能明顯減少CIR后大鼠的腦梗死面積。大鼠腦梗死面積的測定結(jié)果見表1。

表1 大鼠腦梗死面積的測定結(jié)果Tab 1 Results of cerebral ischemic area of rats

3.2 大鼠腦組織水、鈣含量的測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中腦鈣和腦水分含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各用藥組大鼠腦鈣和腦水分含量顯著降低（P＜0.05），且丹參+川芎嗪組比單用藥組效果更好，表明兩藥聯(lián)合應(yīng)用能明顯減少CIR后大鼠的腦鈣和腦水分含量。大鼠腦組織水、鈣含量的測定結(jié)果見表2。

表2 大鼠腦組織水、鈣含量的測定結(jié)果Tab 2 Results of the contents of brain wet and calcium in cerebral tissue of rats

3.3 大鼠腦組織MDA含量、SOD活性的測定結(jié)果

高（P＜0.01），而SOD活性顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，各用藥組大鼠MDA含量顯著降低（P＜0.05），SOD活性顯著增強（P＜0.05），且丹參+川芎嗪組比單用藥組效果更好。大鼠腦組織MDA含量、SOD活性的測定結(jié)果見表3。

表3 大鼠腦組織MDA含量、SOD活性的測定結(jié)果Tab 3 Results of the content of MDA and activities of SOD in cerebral tissue of rats

4 討論

自由基廣泛存在于生物體內(nèi)，正常情況下自由基主要參與體內(nèi)藥物和毒物的降解，殺滅病原體，調(diào)節(jié)機體免疫功能。而體內(nèi)存在許多抗氧化系統(tǒng)能清除自由基，使自由基的生成與清除處于動態(tài)平衡中，所以對機體并無有害影響。當大腦缺血再灌注時，氧自由基生成增多，其機制主要與Ca2+、線粒體、氧自由基和金屬離子等有關(guān)。大量自由基的產(chǎn)生，使其生成與清除失衡，從而引起一系列自由基連鎖反應(yīng)，如過量氧自由基引起局灶性腦缺血再灌注后腦水腫和細胞凋亡等。Toyoda T等[9]已證實在腦缺血再灌注時，通過給予自由基清除劑可明顯減輕腦水腫和縮小梗死體積。Troy CM等[10]發(fā)現(xiàn)，降低SOD水平可誘導(dǎo)細胞凋亡，提示氧自由基可能參與凋亡發(fā)生。Yoshiha S等[11]研究表明，在缺血性腦損傷中，自由基反應(yīng)啟動于缺血期，但明顯過氧化反應(yīng)卻發(fā)生在再灌注期。鑒于自由基在缺血及再灌注損傷中的重要作用，抑制缺血再灌注時自由基的大量產(chǎn)生，減少自由基對機體組織的損害是保護腦組織的首要任務(wù)。

腦水腫包括血管源性腦水腫和細胞中毒性腦水腫，是缺血性腦損傷的并發(fā)癥之一。腦組織含水量越多，表明腦缺血損害更嚴重。本研究表明，模型大鼠用藥后能明顯降低腦組織水分含量，減輕水腫，提示這兩種藥物對大腦組織具有保護作用。

SOD是酶促防御系統(tǒng)中一種重要的氧自由基清除劑，在腦缺血再灌注時，自由基的大量產(chǎn)生，使SOD大量消耗而活性降低，自由基產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡被打破，使細胞組織的結(jié)構(gòu)和功能衰退。本研究表明，丹參和川芎嗪能提高缺血再灌注腦組織中SOD活性，顯示丹參和川芎嗪能增強機體清除自由基的能力，減輕自由基的氧化性損傷，從而起到保護腦細胞的功能，且兩藥聯(lián)合應(yīng)用，效果更佳。

腦組織中富含脂質(zhì)，易與自由基發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而形成大量的脂質(zhì)過氧化物（LPO），其中MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，是許多不飽和脂肪酸的分解產(chǎn)物，MDA含量的升高間接地反映了O－含量的增加，進一步表明生物膜受自由基的損傷程度[12]。用藥各組能夠顯著降低腦組織MDA含量，表明藥物通過增強自由基清除能力和抑制自由基損傷而保護腦組織。

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