HPLC法測定藏藥螃蟹甲中苯乙醇苷類化合物的含量

李茂星，張 超，烏 蘭，尉麗力，邱建國，張泉龍，賈正平(.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥劑科，全軍高原環(huán)境損傷防治重點實驗室，甘肅蘭州 70050;2.蘭州大學生命科學學院，甘肅蘭州 70000;.西北民族大學化工學院，甘肅蘭州 7000)

螃蟹甲為唇形科糙蘇屬多年生草本植物螃蟹(Phlomis younghusbandii Mukerjee)的干燥塊根，藏語稱“露木爾”，為藏醫(yī)習用藥材，廣泛分布于青海、西藏海拔2 700～4 800 m的地區(qū)［1］。傳統(tǒng)中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥理論認為螃蟹甲具有強筋壯骨、祛風活絡、清熱消腫、止咳祛痰的功效，廣泛用于治療咳嗽、感冒、肺炎、支氣管炎、風濕性關節(jié)炎、瘡疥腫毒等疾病。現(xiàn)代藥理研究其鎮(zhèn)咳、祛痰和平喘效果顯著，臨床應用也非常廣泛。作者前期對螃蟹甲的化學成分研究表明螃蟹甲中大量含有環(huán)烯醚萜苷和苯乙醇苷類成分，有關螃蟹甲中環(huán)烯醚萜苷類化合物的含量測定目前已有文獻報道［2，3］，而苯乙醇苷類化合物的含量測定未見報道。藥理學研究表明，苯乙醇苷類化合物具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、增強記憶、保肝和強心等作用［4，5］，可能為螃蟹甲中的活性成分。為了更有效地控制螃蟹甲藥材及其制劑的質量，本測定首次采用HPLC法對不同產(chǎn)地的螃蟹甲藥材和1個螃蟹甲制劑中3個苯乙醇苷類成分的含量進行測定和比較，希望可以為進一步完善該藥材的品質評價及質量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀，包括600型二元梯度泵、996型二極管陣列紫外檢器(美國 Waters公司)，BP210S電子分析天平(Sartorius公司)，SK7200H超聲波清洗器(上?？茖С晝x器有限公司);甲醇為色譜純，水為滅菌注射用水，其余試劑均為分析純;對照品毛蕊花糖苷、alyssonoside、異毛蕊花糖苷均為本實驗室自制［從螃蟹甲藥材中分離得到，經(jīng)光譜學和波譜學分析鑒定其結構(圖1)，經(jīng)HPLC面積歸一化法計算，純度均在98%以上］。螃蟹甲對照藥材由中國藥品生物制品檢定所提供(批號為121407-200401)。螃蟹甲藥材(3份，分別收購于西藏林芝、拉薩、四川成都，經(jīng)蘭州大學藥學院馬志剛教授鑒定為螃蟹甲Phlomis younghusbandii Mukerjee)。螃蟹甲制劑七味螃蟹甲丸(0.25 g/粒，青海琦鷹生物制藥股份有限公司，國藥準字Z20054325，批號20091203)。

圖1 螃蟹甲中的3個苯乙醇苷類化合物的結構

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為 Symmetry C18色譜柱(4.6 mm × 150 mm，5 μm);洗脫流動相為甲醇-水(36∶64)，冰醋酸調(diào) pH 至4.5;流速1.0 ml/min;檢測波長330 nm;柱溫20℃;進樣量10 μl。

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取干燥至恒重的毛蕊花糖苷、alyssonoside、異毛蕊花糖苷各25 mg置25 ml量瓶中，加70%的甲醇至刻度。即得濃度為1 mg/ml的對照品儲備溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取螃蟹甲藥材粉末(過四號篩)1 g，精密稱定;取七味螃蟹甲丸8粒，研細，分別置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 ml，稱定重量，超聲處理45 min，冷卻，再稱定重量，加70%甲醇補足減失的重量，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜濾過，取濾液，即得。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗

2.4.1 理論塔板數(shù)和分離度 在“2.1”項下的色譜條件下，取混合對照品溶液(毛蕊花糖苷、alyssonoside、異毛蕊花糖苷按濃度2∶1∶1混合)，供試品溶液各10 μl，分別進樣，記錄色譜圖，見圖2。在圖2中，毛蕊花糖苷、alyssonoside、異毛蕊花糖苷的保留時間分別為 10.0、14.9、17.4 min，與相鄰峰的分離度均大于1.5，理論踏板數(shù)均大于2 000。

圖2 螃蟹甲藥材HPLC色譜圖

2.4.2 精密度試驗 取毛蕊花糖苷、alyssonoside、異毛蕊花糖苷的混合對照品溶液，在“2.1”項下的色譜條件下，重復進樣6次，進樣量為10 μl，記錄峰面積，計算儀器精密度的RSD，結果毛蕊花糖苷、alyssonoside、異毛蕊花糖苷的RSD分別為1.94%、1.20%、0.75%，表明精密度良好。

2.5 線性關系的考察 分別吸取毛蕊花糖苷儲備液 100、500、900、1 300、1 700、2 100、2 500 μl;alyssonoside 儲備液 50、150、250、350、450、550、650 μl;異毛蕊花糖苷儲備液 50、150、250、350、450、550、650 μl;然后分別依次加入到7個5 ml的容量瓶中混勻，加70%的甲醇定容至刻度。即得不同濃度的3種苯乙醇苷混合對照品溶液。然后按“2.1”項下的色譜條件進行測定，分別進樣10 μl，以峰面積為縱坐標，以濃度為橫坐標進行線性回歸，得各成分回歸方程和線性范圍見表1。

表1 3個苯乙醇苷的回歸方程和線性范圍

2.6 重復性試驗 取同一產(chǎn)地螃蟹甲樣品6份，按照“2.3”項下供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，然后按“2.1”項下色譜條件進行測定，每次進樣10 μl，分別測定峰面積，計算含量，結果測得毛蕊花糖苷、alyssonoside、異毛蕊花糖苷含量分別為 3.15、1.10、1.35 mg/g;RSD分別為1.74%、1.99%、1.48%。

2.7 加樣回收率試驗 精密稱取適量已知含量的購自四川成都的螃蟹甲藥材粉末6份，分別精密加入一定量的毛蕊花糖苷、alyssonoside、異毛蕊花糖苷對照品，按照“2.3”項下方法制備樣品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進行測定，計算加樣回收率，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗(n=6)

2.8 耐用性

2.8.1 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件，每次進樣 10 μl，分別在 0、2、4、8、12、24、48、72 h 測定峰面積，結果毛蕊花糖苷、alyssonoside、異毛蕊花糖苷的 RSD分別 1.87%、1.34%、2.71%。表明樣品溶液在72 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8.2 流動相的組成比例和pH值 在研究分析方法的過程中可以看出，流動相中甲醇和水相的比例有小的變動(1%左右)，pH值在4.0～5.0之間變化，對測定結果無明顯的影響。

2.9 樣品含量測定 分別取不同來源的螃蟹甲樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件進行測定，進樣10 μl，采用外標法以峰面積計算3個苯乙醇苷的含量，結果見表3。

表3 螃蟹甲中3個苯乙醇苷的測定結果(n=3)

3 討論

3.1 本實驗首次建立了藏藥螃蟹甲中苯乙醇苷類化合物的HPLC含量測定方法，并測定了不同產(chǎn)地螃蟹甲藥材和1個螃蟹甲制劑中3個苯乙醇苷的含量，方法穩(wěn)定可靠，重復性好，適合于螃蟹甲的質量控制。

3.2 在供試品制備方法上，考察了甲醇、70%甲醇和50%甲醇對苯乙醇苷提取效率的影響，結果表明以70%的甲醇作為提取溶劑效率最高。在此基礎上，比較了熱回流和超聲對提取結果的影響，結果表明超聲法提取效率高。以70%甲醇做提取溶劑，分別超聲30、45、60 min，結果超聲 45、60 min 均較 30 min提取完全，但兩者差異較小。故確定70%甲醇超聲提取45 min作為供試品制備方法，既簡便可靠，又不會造成有效成分的破壞。

3.3 檢測波長的選擇:利用二極管陣列紫外檢測器檢測，將對照品溶液在200～500 nm進行在外掃描，結果表明，3個苯乙醇苷成分在330 nm波長下均有較大吸收，故選擇330 nm作為檢測波長。

3.4 實驗結果表明，在不同產(chǎn)地螃蟹甲藥材和1個螃蟹甲制劑中均檢測到3個苯乙醇苷類成分的存在，總體看來，毛蕊花糖苷＞isoacteoside＞異毛蕊花糖苷。但是，這種含量差異與其中的環(huán)烯醚萜苷類成分一樣沒有明顯的規(guī)律性［5］。考慮到螃蟹甲藥材采集困難，樣本量較少，其普遍性還有待進一步研究。苯乙醇苷和環(huán)烯醚萜苷類成分在螃蟹甲藥材中含量很大，很可能為螃蟹甲中的活性成分。因此，建議在建立螃蟹甲藥材及其制劑質量標準的同時應測定苯乙醇苷和環(huán)烯醚萜苷類成分。

［1］中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志(65卷第二分冊)［M］.北京:化學工業(yè)出版社，1995:126，231.

［2］趙 斌，董小萍，吳健明.HPLC法測定螃蟹甲中山梔苷甲酯的含量［J］.藥物分析雜志，2009，29(2):323.

［3］張軍莉，徐 娟，李茂星.HPLC法測定了藏藥螃蟹甲中8-乙酰氧基山梔子苷甲酯的含量［J］.解放軍藥學學報，2009，25(3):261.

［4］靖 會，佐建鋒，李教社.苯乙醇苷類化合物的藥理研究進展［J］.時珍國醫(yī)國藥，2006，17(3):440.

［5］許敬英，蘇 奎，周 靜.苯丙素苷類化合物的研究進展(Ⅱ)［J］.時珍國醫(yī)國藥，2007，18(7):1770.