HPLC-DAD法對扶正平消膠囊中龍膽苦苷的含量研究

姜云霞，戰(zhàn) 旗，金柔男，朱張超，王 彬(上海東方肝膽外科醫(yī)院藥材科，上海 200438)

扶正平消膠囊是由黃芪、當(dāng)歸、全蝎、蜈蚣等二十八味中藥組成的復(fù)方制劑。對于這二十八味中藥大復(fù)方制劑，我院現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有黃芪、浙貝母及狼毒這三味藥材的薄層鑒別，無法滿足《中國藥典》2010版一部對于中藥制劑的標(biāo)準(zhǔn)要求。因此為了提高醫(yī)院制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，我們選擇復(fù)方中比重最大的藥材之一龍膽作為研究對象，進行含量測定方面的研究。

龍膽藥材其化學(xué)成分含裂環(huán)烯醚萜苷類苦味成分(龍膽苦苷，當(dāng)藥苦苷，當(dāng)藥苷，苦龍膽酯苷，痕量苦當(dāng)藥酯苷)，生物堿(龍膽堿)［1～3］?！吨袊幍洹?010版中將龍膽苦苷作為控制龍膽藥材的指標(biāo)，其中龍膽苦苷含量可高達3.0%。其含量測定方法有多種，包括高效液相色譜法［4］，薄層色譜掃描法［5］，

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［6］，毛細(xì)管電泳法［7］等。其中高效液相色譜法在中藥制劑分析中具有較多優(yōu)點，包括速度快，分辨率高，并且用一根色譜柱可分離不同的化合物并且可反復(fù)使用等等。因此，我們首先考慮使用高效液相色譜法對扶正平消中龍膽苦苷進行含量測定的研究。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Agilent 1100 Series(安捷倫)高效液相色譜儀(G1379A脫氣閥，G1311A泵，G1367A進樣器，G1316A柱溫箱，G1314A紫外檢測器)，AE240電子天平(德國梅特勒)，SK2200H型超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 扶正平消膠囊由第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院制劑室生產(chǎn)(批號:080901，081101，090101，090301，090801，091201)，龍膽苦苷對照品購自中國藥品生物制品檢定所(110770-200712)，無水乙醇、磷酸、甲醇等均為分析純，流動相甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法和結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取龍膽苦苷對照品6.1 mg，加19%甲醇溶解定容置25 ml量瓶中，配成濃度為244 μg/ml龍膽苦苷對照品母液。精密吸取上述對照品母液10 ml，用19%甲醇稀釋定容置25 ml量瓶中，得對照品母液濃度為 97.60 μg/ml，再分別精密吸取上述對照品母液 0.5、1、2、4、6、8 ml，用19%甲醇分別稀釋定容置10 ml量瓶中，得對照品標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，濃度依次為 4.88、9.76、19.52、39.04、58.56、78.08 μg/ml。

2.2 供試品溶液的制備 取扶正平消膠囊10粒的內(nèi)容物，混勻，精密稱定，加40%甲醇溶解定容置50 ml量瓶中，靜置12 h，超聲1 h，放冷，稀釋至刻度，混勻，用微孔濾膜(0.22 μm)濾過，取續(xù)濾液即得。

2.3 色譜條件 色譜柱 Agilent Zorbax XDB-C8(4.6 mm ×150 mm，5 μm)，流動相為甲醇-水(19∶81)，檢測波長 275 nm，流速 1 ml/min，柱溫為 25℃，進樣量 20 μl。

2.4 陰性供試品的制備及考察 取處方量藥材(全蝎、蜈蚣由廠家提取)加水回流提取2次，每次2 h，水量分別為10、8倍量，過濾，得濾液;濾液濃縮至相對密度1.1，加乙醇至乙醇終濃度為60%，放置24 h，過濾得濾液。合并全蝎、蜈蚣濾液，回收乙醇，濃縮，干燥，粉碎，過120目篩，即得陰性樣品。按照供試品溶液的制備方法項下制備陰性樣品溶液，20 μl進樣測定。樣品圖中目標(biāo)峰后還有一小峰，通過計算得出其分離度R=1.76，符合色譜圖分離要求。色譜圖見圖1。

2.5 線性關(guān)系的考察 分別將不同濃度的對照品溶液依次連續(xù)進樣，重復(fù)5次，以對照品溶液的濃度(X，μg/ml)對對照品的峰面積(Y)進行線性回歸。得到龍膽苦苷的回歸方程為Y=23.82X－7.170(r=0.999 9)，在 4.88 ～ 97.60 μg/ml之間的線性關(guān)系良好。以信噪比10∶1確定最低定量限為0.244 μg/ml。

2.6 精密度試驗

2.6.1 日內(nèi)精密度 取上述對照品溶液中的4.88、39.04、97.60 μg/ml 3 個濃度各 20 μl進樣，早、中、晚各一次，記錄各色譜峰的峰面積，計算得RSD 值依次為 1.06%、1.47%、1.68%，日內(nèi)精密度均小于2%，符合檢測要求。

2.6.2 日間精密度 取上述對照品溶液中的4.88、39.04、97.6 μg/ml 3 個濃度各 20 μl進樣，連續(xù)測定5 d，記錄各色譜峰的峰面積，計算得RSD值依次為1.35%、1.55%、2.75%，日間精密度均小于3%，符合檢測要求。

圖1 HPLC色譜圖

2.7 回收率試驗 取090301批號扶正平消膠囊10粒，精密稱定2.528 40 g，加40%甲醇49 ml及39.04 μg/ml龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)液 1 ml，靜置 12 h，超聲1 h，靜置，過濾即得。取20 μl進樣，測定4次。結(jié)果顯示樣品加樣回收率為99.39%，在95% ～105%之間，符合檢測要求。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取對照品溶液 4.88、39.04、97.6 μg/ml 3 個濃度，分別于 0、12、24、48、72、96 h進樣 20 μl，測得峰面積，計算得 RSD值依次為1.47%、4.26%、3.87%。在符合要求的情況下，取相對回收率試驗時配制的樣品，于 0、12、24、48、72、96 h進樣20 μl，結(jié)果得 RSD值為3.83%。結(jié)果顯示，龍膽苦苷對照品及龍膽苦苷在扶正平消膠囊中含量在96 h內(nèi)穩(wěn)定。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 文獻檢索發(fā)現(xiàn)潘利明等［4］將270 nm作為龍膽苦苷的最大吸收波長，而高言明等［7］使用275 nm作為最大吸收波長。本實驗中，我們通過對對照品龍膽苦苷進行DAD測定，發(fā)現(xiàn)275 nm為最大吸收波長，光譜圖見圖2。

3.2 色譜柱的選擇 我們選擇了幾種不同的色譜柱進行考察，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用XDB-C8(4.6 mm×150 mm，5 μm)有更好的效果，峰形有分離的趨勢，且保留時間良好。因此在此基礎(chǔ)上進行進一步優(yōu)化。

圖2 龍膽苦苷光譜圖

3.3 溶劑的選擇 我們選擇了100%、50%、19%甲醇以及100%乙醇與純水為溶劑溶解樣品進行考察，分別進樣，其中50%甲醇溶解較好。后又進樣發(fā)現(xiàn)，50%甲醇溶解時，有峰傾斜的現(xiàn)象，不利于定量分析，所以又嘗試其他濃度甲醇溶解，最后發(fā)現(xiàn)40%甲醇溶解時，峰面積最高。具體結(jié)果見圖3。

圖3 光譜圖(40%甲醇為溶劑)

3.4 流動相的選擇 通過實驗研究，我們考察的范圍為甲醇-水(25∶75，23∶77，21∶79，19∶81)，我們發(fā)現(xiàn)，隨著甲醇比例的減少，分離度越來越高。當(dāng)甲醇-水比例為19∶81時，龍膽苦苷峰能與前一干擾峰完全分離，并且出峰時間在15 min內(nèi)，符合分離度的要求。具體結(jié)果見表1。

表1 龍膽苦苷峰流動相甲醇-水比例與分離度的關(guān)系

4 樣品測定

取不同批號的扶正平消膠囊按照供試品溶液配制方法制備供試品溶液，各取20 μl進樣，每個樣品重復(fù)2次。結(jié)果見表2。

2010版藥典一部規(guī)定，龍膽藥材中龍膽苦苷的含量應(yīng)不低于3.0%，同時根據(jù)龍膽藥材占處方中比例計，龍膽苦苷理論含量應(yīng)不低于0.16 mg/粒;而測定結(jié)果顯示只有090101、090301兩批號符合此要求。同時批號080901、081101含量低于0.16 mg/粒，我們懷疑是由于此制劑放置時間超過1年半，有可能龍膽苦苷分解導(dǎo)致含量降低。批號091201中龍膽苦苷含量低于0.16 mg/粒，我們懷疑有可能是更換了生產(chǎn)廠家，供應(yīng)的藥材與前一廠家不同，造成含量偏低。而批號090101、090301測定的含量大于0.16 mg/粒，雖然其放置時間超過一年保質(zhì)期。

表2 樣品中龍膽苦苷含量測定結(jié)果

5 結(jié)論

本法專屬性強，靈敏度高，選擇性好，可用于測定扶正平消膠囊中龍膽苦苷的含量。

［1］Anonymous.Reports on phytotherapy findings from L.Y.Chen and co-researchers provide new insights［J］.Drug Week，2010，26(2):1658.

［2］Anonymous.University of Liege details research in natural products［J］.Science Letter，2009，3(2):1830 .

［3］Anonymous.Study results from Northwest University，College of Life Science provide new insights into analgesics［J］.Pain ＆Central Nervous System Week，2008，11(8):314.

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［5］鐘 強，謝 嬌，潘 洪.雙波長薄層掃描法測定瀉膽丸中龍膽苦苷的含量［J］.時珍國醫(yī)國藥，2004，15(7):393.

［6］馮 怡，鄧遠輝，曾 星，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定人血漿中的龍膽苦苷濃度［J］.藥物分析雜志，2007，27(02):157.

［7］高言明，宋 勤，陳惠玲，等.高效毛細(xì)管電泳測定龍膽中龍膽苦苷的含量［J］.藥物分析雜志，2007，27(02):1572.

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