舒肝安樂寧浸膏對小鼠急性酒精性肝損傷保護作用的研究

夏愛軍，張 琪，張云波，梁 園，唐 哲，周寧寧(解放軍第303醫(yī)院藥劑科，廣西南寧 530021)

1 前言

舒肝安樂寧由葉下珠、鱉甲、郁金、茵陳、黃芪、絞股藍、白花蛇舌草、梔子、甘草等中藥組成，具疏肝解郁、軟堅散結、清肝利濕、利水消腫、解毒等功效，為解放軍第303醫(yī)院多年用于臨床治療肝炎的復方制劑，臨床療效確切。前期研究發(fā)現(xiàn)，舒肝安樂寧對四氯化碳(CCl4)所致急性肝損傷小鼠具有一定的保護作用［1］，但其對酒精性肝損傷的治療作用尚未見報道。有關小鼠急性酒精性肝損傷，國內已有多個專家做過系統(tǒng)研究，并建立了成熟的動物模型［2，3］。本實驗旨在通過舒肝安樂寧對酒精誘導小鼠急性肝損傷模型進行研究，揭示其對此類損傷潛在的預防保護作用。

2 材料

2.1 實驗藥物與試劑 舒肝安樂寧［自制，3.55 g(生藥)/ml，每 ml含沒食子酸不少于 0.32 mg，方中各飲片購于南寧生源中藥飲片有限責任公司］;56°北京紅星二鍋頭白酒(北京紅星釀酒廠，用蒸餾水配制成含酒精50%的白酒);丙氨酸氨基轉移酶(ALT)試劑盒(批號:20071203)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)試劑盒(批號:20071203)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號:20071112)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號:20071112)，均購自南京建成生物制劑公司;甘油三酯(TG)試劑盒(批號:2008040024)購自浙江東甌生物工程有限公司。

2.2 儀器 Centrifuge 5415D高速低溫離心機(德國Eppendorf);LG16-W型離心機(北京醫(yī)用離心機廠);80-2離心機(上海手術器械廠);722-紫外分光光度計(上海第三分析儀器廠);SynergyHT多功能酶標儀(美國BIOTEK公司);FJ-200型高速分散勻質機(上海標本模型廠);TG328A型電子分析天平;Olympus光學顯微鏡。

2.3 動物 昆明(KM)小鼠，SPF級，體重(20±2)g，雌雄各半，50只，由廣西食品藥品檢驗所動物中心提供(合格證號:SCXK桂2003-0001)。

3 方法

3.1 動物分組與給藥 將小鼠隨機分為正常組、模型組、舒肝安樂寧低、中、高劑量組(5、10、20 g/kg，原生藥材量分別相當于臨床成人給藥劑量的0.5、1、2倍)，每組10只。正常組和模型組灌胃10 ml/kg的生理氯化鈉溶液，其它各組灌胃同等容量的相應藥物，每日1次，連續(xù)30 d。實驗結束時除正常組外其余各組均1次灌胃給予50%酒精(12 ml/kg)，正常對照組給予蒸餾水。

3.2 血清AST、ALT活性的測定 末次給藥后禁食16 h，摘眼球取血，分離血清，AST和ALT活性的測定按試劑盒說明操作。

3.3 肝臟SOD活性、MDA、TG含量的測定 取血后脫頸椎處死小鼠，取出肝臟，用生理氯化鈉溶液制備成10%肝勻漿，SOD活性、MDA、TG含量的測定按試劑盒說明操作。

3.4 各組小鼠肝臟病理切片的觀察 取部分肝組織作冰凍切片，用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察。

3.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，計量數(shù)據(jù)以表示。

4 結果

4.1 對急性酒精性肝損傷小鼠血清AST、ALT的影響 與空白組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST含量明顯升高(P＜0.01)，說明肝細胞受損，本次實驗小鼠急性酒精性肝損傷模型制作成功。與模型組比較，舒肝安樂寧各劑量組能顯著降低小鼠血清中AST、ALT 活性 (P ＜0.05或 P ＜0.01)。結果見表1。

表1 舒肝安樂寧浸膏對酒精所致急性肝損傷小鼠血清 ALT、AST 的影響(ˉx ±s，n=10)

4.2 對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟SOD活性和MDA、TG含量的影響 與空白組比較，模型組小鼠肝臟中MDA、TG含量明顯升高，SOD活性下降。與模型組比較，舒肝安樂寧各劑量組能顯著降低小鼠肝臟中MDA、TG含量，升高SOD活性 (P＜0.05或P ＜0.01)。結果見表2。

表2 舒肝安樂寧浸膏對急性肝損傷小鼠肝臟SOD、GSH活性及MDA含量的影響( ，n=10)

表2 舒肝安樂寧浸膏對急性肝損傷小鼠肝臟SOD、GSH活性及MDA含量的影響( ，n=10)

1)P ＜0.05，2)P ＜0.01，與空白組比較;3)P ＜0.05，4)P ＜0.01，與模型組比較。

4.3 對急性酒精性肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響 光鏡下，空白組小鼠肝小葉結構清晰，肝索放射狀排列，肝細胞結構清晰，無變性壞死，核居中;肝竇無明顯擴張淤血，匯管區(qū)未見炎細胞浸潤。模型組小鼠部分肝細胞腫脹，脂滴彌漫，核居中，部分肝竇擴張淤血，部分肝組織見點狀壞死，肝小葉及匯管區(qū)見炎細胞浸潤。舒肝安樂寧各劑量組均能減輕肝細胞腫脹程度及脂滴情況，以舒肝安樂寧高劑量組效果較好。結果表明，舒肝安樂寧可減輕酒精性肝損傷小鼠肝細胞的脂肪變性。結果見圖1。

5 討論

酒精(主要成分是乙醇)進入機體后，約90%在肝臟內氧化，體內少量乙醇可在ADH和ALDH作用下代謝生成CO2和H2O排出體外。一次性大量或長期慢性攝入酒精，血中乙醇濃度過高，超過肝臟正常生理代謝的解毒能力，產生大量自由基。過量的自由基可引起肝細胞膜發(fā)生脂質過氧化反應，使細胞膜和細胞器結構破壞，膜流動性失常，大量肝內酶(AST、ALT)釋放入血，并可使清除自由基酶(SOD等)耗竭，肝細胞損傷進一步加重，肝功能異常，脂肪代謝紊亂，肝組織細胞脂肪樣和空泡樣變性，最終導致肝細胞廣泛壞死，細胞腫脹死亡［4，5］，從而引起酒精性肝病。到目前為止，酒精性肝病已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病［6］。

SOD是生物體內的主要抗氧化劑，通過清除生物氧化產生的自由基而起保護細胞的作用，其活力的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力，是反映抗氧化損傷的主要指標;而自由基對細胞的損傷程度可通過脂質過氧化的降解產物——MDA含量間接推斷。近年研究發(fā)現(xiàn)，乙醇的代謝物乙醛可以動員皮下脂肪酸向肝內轉移，造成肝內TG含量的升高，逐漸形成脂肪肝。TG可以評價脂肪在肝細胞內堆積情況。因而測定MDA、TG、SOD的變化可反映機體脂質過氧化的程度和藥物抗氧化能力。

舒肝安樂寧是為解放軍第303醫(yī)院多年用于臨床治療肝炎的復方制劑，由葉下珠、鱉甲、郁金、茵陳等多味中藥組成，虛實兼顧，具有活血化瘀，保肝護肝，清除自由基，增強機體免疫力的功效［7～11］。本院多年臨床實踐證實，舒肝安樂寧治療肝炎效果明顯。前期藥理研究發(fā)現(xiàn)，本方對CCl4造成的急性肝損傷小鼠具一定的保護作用。

本實驗中，小鼠經酒精損傷后肝功能指標(ALT、AST)明顯升高，同時出現(xiàn)不同程度的病理改變，證明造模成功。舒肝安樂寧可以降低肝損傷小鼠血清中AST、ALT，增強肝臟中SOD活性，降低MDA、TG含量。其護肝作用可能與以下成分有關:①葉下珠平肝清熱，利水解毒。主要有效成分沒食子酸、葉下珠素能明顯降低 ALT、AST水平［12，13］。②黃芪補中益氣，改善微循環(huán)，改善肝臟供血和營養(yǎng);所含微量元素硒能提高GSH-Px活性，激活解毒酶系［14］。③絞股藍總皂苷能降低脂質過氧化反應，提高其血漿中SOD的活性［15］。④白花蛇舌草中的多酚、黃酮、羥基蒽醌、有機酸類能改變氧化態(tài)或烯醇式與酮式官能團互變異構的化學特征，具有較強的抗氧化活性［16］。⑤郁金、茵陳、梔子、甘草臨床常用于治療各種肝膽疾病?！八幱袀€性之特長，方有合群之妙用”。目前為止，舒肝安樂寧的護肝機理研究還不夠深入，還需更細致的研究，以便為臨床用藥提供可靠的理論依據(jù)。

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