用細(xì)胞膜色譜法和HPLC-TOF/MS研究附子中的有效成分

曹 巖，景 晶，呂狄亞，朱臻宇，張國(guó)慶，柴逸峰(.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 00433;.東方肝膽外科醫(yī)院藥材科，上海 00438)

細(xì)胞膜色譜(cell membrane chromatography，CMC)是將細(xì)胞膜結(jié)合到硅膠表面，制成細(xì)胞膜固定相，利用色譜學(xué)技術(shù)研究流動(dòng)相中藥物與受體相互作用規(guī)律的受體動(dòng)力學(xué)新方法［1，2］。細(xì)胞膜色譜中的細(xì)胞膜固定相具有細(xì)胞膜活性和色譜分離的雙重特性，藥物可以不經(jīng)分離步驟，直接在相應(yīng)的細(xì)胞膜色譜上完成篩選過程，其篩選系統(tǒng)是藥物研究的高通量篩選提供細(xì)胞膜篩選平臺(tái)。由細(xì)胞膜色譜模型獲得的色譜保留參數(shù)(容量因子)與藥物的藥理作用密切相關(guān)，對(duì)藥物異構(gòu)體有識(shí)別能力，具有操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠、高效靈敏的優(yōu)點(diǎn)［3］。目前細(xì)胞膜色譜已經(jīng)應(yīng)用在藥理學(xué)研究的多個(gè)方面，其中將細(xì)胞膜色譜與藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)合的活性成分篩選技術(shù)已用于天然植物和中藥物質(zhì)基礎(chǔ)的研究［4，5］。附子是毛茛科植物烏頭的子根，具有回陽(yáng)救逆，補(bǔ)火助陽(yáng)，散寒止痛的功效。附子的臨床應(yīng)用十分廣泛，常與其它中藥配伍成方劑應(yīng)用于臨床。藥理研究表明，附子有對(duì)心血管系統(tǒng)的作用:正性肌力、強(qiáng)心、抗心律失常、舒張血管等。此外還包括增強(qiáng)免疫，抗炎鎮(zhèn)痛，抗衰老，抗腫瘤等作用［6］。附子中所含的烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿等雙酯型生物堿既是有效成分，又是毒性成分［7］。目前，對(duì)于附子的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)、附子的藥效及毒性作用機(jī)制等研究的比較多，但對(duì)于附子中的藥效、毒性成分有幾個(gè)，其含量研究還不夠深入。

本研究采用細(xì)胞膜色譜技術(shù)初步篩選附子中的有效成分，再采用HPLC-TOF/MS技術(shù)對(duì)有效成分進(jìn)行鑒定，確定了8個(gè)可能的有效成分。

1 儀器與試藥

Waters 515液相色譜儀，包括Waters 996二極管陣列檢測(cè)器、柱溫箱、Millennium工作站。Agilent 1200液相色譜儀，包括在線真空脫氣機(jī)、二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱;Agilent G6220A飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，包括標(biāo)準(zhǔn)電噴霧離子源(ESI)，MassHunter色譜工作站和Qualitative Analysis質(zhì)譜分析軟件。QL-901旋渦混合器;KUDOS SK5200H超聲波清洗器;HITACHI SCR20BA大型高速冷凍離心機(jī)。

色譜純乙腈(Merck，Germany);色譜純甲酸(Tedia，USA);NaH2PO4·2H2O，Na2HPO4·12H2O，NaCl，分析純無水乙醇(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司);娃哈哈純凈水;空色譜柱、大孔硅膠(上海月旭材料科技有限公司);熟附片(上海雷允上藥業(yè));丹酚酸B(中國(guó)藥品生物制品檢定所);呋塞米注射液(上海禾豐制藥有限公司);鹽酸多巴酚丁胺注射液(上海信誼藥廠有限公司);甲磺酸酚妥拉明注射液(上海旭東海普藥業(yè)有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 附子提取液的制備 取5 g熟附片藥材，加10倍量水，回流提取3次，每次1.5 h，合并提取液。將提取液濃縮放冷后，加入2倍量無水乙醇，4℃放置過夜。減壓過濾后回收乙醇，將濾液濃縮至20 ml，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得附子提取液。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 以丹酚酸B、呋塞米為陰性對(duì)照品，以多巴酚丁胺、酚妥拉明為陽(yáng)性對(duì)照品。用10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液分別溶解并稀釋對(duì)照品，至對(duì)照品溶液濃度為500 μg/ml。

2.3 大鼠心肌細(xì)胞膜色譜柱的制備 取健康SD大鼠2只，猛擊頭部致死，迅速取出心臟并減去心房，根據(jù)文獻(xiàn)［8］的方法，制備大鼠心肌細(xì)胞膜。再根據(jù)文獻(xiàn)［1，9］的方法制備大鼠心肌細(xì)胞膜色譜柱。

2.4 細(xì)胞膜色譜實(shí)驗(yàn) 色譜柱:大鼠心肌細(xì)胞膜色譜柱(30 mm × 2.1 mm，5 μm);柱溫:37 ℃;流動(dòng)相:10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液;流速:0.2 ml/min;進(jìn)樣量:5 μl;檢測(cè)波長(zhǎng):附子為230 nm，呋塞米為330 nm，其他對(duì)照品均為280 nm。用流動(dòng)相平衡60 min后進(jìn)樣分析。

2.5 HPLC-TOF/MS 實(shí)驗(yàn)

2.5.1 色譜條件 色譜柱:SHISEIDO CAPCELL PAK C18(4.6 mm × 150 mm，5 μm)，流動(dòng)相:A 為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈，梯度洗脫，具體梯度洗脫條件見表 1;柱溫:25 ℃，進(jìn)樣量:5 μl，流速:1.0 ml/min。

表1 梯度洗脫條件

2.5.2 質(zhì)譜條件 電噴霧正離子模式;質(zhì)量掃描范圍:100～1 200 m/z;毛細(xì)管電壓:4 000 V;霧化氣壓力:30 psig;干燥氣流速:10.0 L/min;干燥氣溫度:350℃;碎片電壓:160 V。分流比:1∶3。

3 結(jié)果與討論

3.1 細(xì)胞膜色譜模型的考察 采用具有抗氧化作用的丹酚酸B和具有利尿作用的呋塞米為陰性對(duì)照品，采用β1腎上腺素受體激動(dòng)藥多巴酚丁胺和α腎上腺素受體阻斷藥酚妥拉明為陽(yáng)性對(duì)照品，對(duì)大鼠心肌細(xì)胞膜色譜模型進(jìn)行了考察，4種藥物在該細(xì)胞膜色譜柱上的保留情況如圖1所示。其中丹酚酸B和呋塞米在該色譜柱上均無保留，而多巴酚丁胺和酚妥拉明均有明顯的保留，其保留時(shí)間分別為5.77 min和10.17 min。結(jié)果表明該細(xì)胞膜色譜模型對(duì)作用于α、β腎上腺素受體的藥物的保留具有選擇性，可以用于中藥中此類作用成分的篩選。

圖1 4種對(duì)照品的細(xì)胞膜色譜圖

3.2 細(xì)胞膜色譜實(shí)驗(yàn) 將附子提取液進(jìn)行大鼠心肌細(xì)胞膜色譜分析，結(jié)果如圖2所示?？梢姼阶又泻心芘c心肌細(xì)胞膜上的受體相互作用的成分，這些成分可能就是附子中的有效成分。各個(gè)組分的保留時(shí)間不同說明其與受體的親和力不同，保留時(shí)間長(zhǎng)的親和力強(qiáng)，保留時(shí)間短的親和力弱。由于附子中的有效成分可能是結(jié)構(gòu)相近的一類化合物，因此所有保留組分在細(xì)胞膜色譜上并未得到完全分離。為了進(jìn)一步鑒定各個(gè)可能的有效成分，分別收集具有明顯保留特性的組分R1(4～6 min)、R2(6～8 min)、R3(8～12 min)和R4(12～16 min)。

圖2 附子提取液的細(xì)胞膜色譜圖

3.3 HPLC-TOF/MS實(shí)驗(yàn) 將收集到的細(xì)胞膜色譜的保留組分 R1、R2、R3、R4和附子提取液直接進(jìn)行HPLC-TOF/MS分析，結(jié)果如圖3所示。通過與附子提取液的質(zhì)譜總離子流圖相比較，可以分別從R1、R2、R3和R4組分中發(fā)現(xiàn)均含有附子的成分，再結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)［10、11］的報(bào)道，從附子的化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出8種可能的有效成分，如表2、圖4所示。R1中主要含有新烏頭原堿(Mesaconine);R2中主要含有苯甲酰新烏頭胺(Benzoylmesaconine);R3中含有尼奧靈(Neoline)、附子靈(Fuziline)、苯甲酰烏頭胺(Benzoylaconine)，其含量差別不大;R4中主要含有苯甲酰次烏頭胺(Benzoylhypaconine)，塔拉定(Talatizidine)和 Chuanfumine。

圖2 附子提取液及細(xì)胞膜色譜保留組分的質(zhì)譜總離子流圖

表2 附子中可能的有效成分的鑒定結(jié)果

圖4 附子中可能的有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

3.4 篩選結(jié)果 附子中的雙酯型生物堿如烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿在加熱的過程中水解成為相應(yīng)的單酯型的苯甲酰烏頭胺、苯甲酰新烏頭胺和苯甲酰次烏頭胺，后者又可以繼續(xù)水解為不含酯鍵烏頭原堿、新烏頭原堿和次烏頭原堿，因此實(shí)驗(yàn)中主要檢測(cè)到單酯型的生物堿。細(xì)胞膜色譜的篩選結(jié)果表明，單酯型的苯甲酰烏頭胺、苯甲酰新烏頭胺和苯甲酰次烏頭胺是附子中的有效成分，這與目前認(rèn)為附子中的主要藥效和毒性成分是烏頭堿相一致。結(jié)果同時(shí)表明，塔拉定、尼奧靈和附子靈等也可能是附子中的有效成分，雖然其含量不多，但其在細(xì)胞膜色譜上的保留時(shí)間較長(zhǎng)，具有較強(qiáng)的親和力，值得進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究采用細(xì)胞膜色譜技術(shù)和HPLC-TOF/MS技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)附子中作用于心肌細(xì)胞膜上受體的有效成分的初步篩選和鑒定，共確定了8個(gè)可能的有效成分，其藥理作用還需要進(jìn)一步研究。該方法充分利用了細(xì)胞膜色譜技術(shù)簡(jiǎn)便、高通量篩選的優(yōu)勢(shì)，并利用了液相色譜技術(shù)彌補(bǔ)了細(xì)胞膜色譜法無法有效分離和鑒定的不足，同時(shí)由于HPLCTOF/MS具有更高的靈敏度，使得細(xì)胞膜色譜的保留成分不必經(jīng)過濃縮就可以直接進(jìn)樣進(jìn)行色譜分析，操作簡(jiǎn)便、節(jié)省時(shí)間和成本。為從天然產(chǎn)物中快速尋找新的活性成分提供了途徑。

［1］He LC，Yang GD，Geng XD.Enzymatic activity and chromatographic characteristics of the cell membrane immobilized on silica surface［J］.Chin Sci Bull，1999，44(9):826.

［2］He LC，Wang SC，Geng XD.Coating and fusing cell membranes onto a silica surface and their chromatographic characteristics［J］.Chromatographia，2001，54(1):71.

［3］袁秉祥，賀浪沖，楊廣德.細(xì)胞膜生物親和色譜藥物篩選系統(tǒng)［J］.中國(guó)藥理通訊，2003，20(3):68.

［4］方藝霖，張藝卜，肖小河，等.細(xì)胞膜色譜技術(shù)用于中藥活性成分篩選的研究進(jìn)展［J］，中草藥，2008，39(7):1119.

［5］聶 紅，孟蘭貞.細(xì)胞膜色譜及其在中藥活性成分研究中的應(yīng)用［J］.中華實(shí)用中西醫(yī)雜志，2004，4(17):334.

［6］閻愛榮，張 宏.附子的藥理研究［J］.中國(guó)藥物與臨床，2008，8(9):745.

［7］張菊花，張曉艷.探析不同炮制方法對(duì)附子藥理作用及毒性的影響［J］.海峽藥學(xué)，2008，20(10):89.

［8］徐叔云，卞如濂，陳 修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.第2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，l994:522.

［9］賀浪沖.細(xì)胞膜色譜法［D］.西安:西北大學(xué)，1998:27.

［10］李 翔.四逆湯化學(xué)成分和抗心肌缺血作用的研究［D］.上海:第二軍醫(yī)大學(xué)，2008:91.

［11］Hu R，Zhao J，Qi LW，et al.Structural characterization and identification of C(19)-and C(20)-diterpenoid alkaloids in roots of Aconitum carmichaeli by rapid-resolution liquid chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry［J］.Rapid Commun Mass Sp，2009，23(11):1619.