沙棘脂肪酸對老齡雌性大鼠線粒體功能影響的研究

申屠平平,魏霞蓁,王振林,郭劍峰,宋蘭蘭

(1.西安交通大學天奎醫(yī)藥生物公司,陜西西安 710061;2.浙江省金華市疾病預防控制中心,浙江金華 321000;3.西安交通大學醫(yī)學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室,陜西西安 710061)

沙棘脂肪酸組成分制備的更年期的中藥制品,前期研究已證明具有調節(jié)內分泌、調節(jié)免疫功能、改善血液流變性和抗組織細胞衰老等作用,臨床用以治療婦女更年期綜合征。本文為了探索衰老形成的作用機制,以沙棘脂肪酸配制成為能量調節(jié)劑,以線粒體為調控靶標,觀察老年雌性大鼠線粒體內膜蛋白及輔酶成分,呼吸鏈功能、ATP生成等調節(jié)因素對衰老形成的影響,以揭示沙棘脂肪酸具有增加線粒體內膜蛋白及輔酶活性、調整改善呼吸鏈功能、促進機體多功能組織、細胞的新陳代謝等作用[1]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高通量酶標儀 (德國BMG公司);超高速冷凍離心機 (美國BECKMAN公司);生物氧特性微機測量分析儀 (北京空軍第六裝備研究所);DY89—Ⅱ型電動勻漿機 (寧波新芝);759紫外分光光度計 (浙江福立分析儀器有限公司)。

1.2 藥物

沙棘脂肪酸組成分 (由西安交大天奎醫(yī)藥生物公司提供,批號 20040605。取內容物為4.50g/kg、2.25g/kg、1.125g/kg乳劑);已烯雌酚 (天津力生制藥股份有限公司,產(chǎn)品批號0401200,溶于同種賦形劑制成0.02mg/kg乳劑);賦形劑為0.72g/kg的伯洛沙姆。

1.3 試劑

EDTA-2Na、ATP-2Na(Amresco公司);氯化鎂 (上海生工生物工程有限公司);維生素C、琥珀酸鈉、蘋果酸、琥珀酸、硼氫化鈉、細胞色素 C、魚藤酮、抗霉素A、CoQ10、蔗糖(Sigma公司);2,6-二氯酚靛酚 (2,6-DCPIP)(Fluka公司);琥珀酸脫氫酶、ATP酶測試盒、總蛋白測試盒、總蛋白標準品、磷測試盒 (南京建成生物工程研究所);其余生化試劑均為分析純。

1.4 動物及分組

健康20月齡Wistar雌性大鼠63只,質量(300±12)g,由北京中科院藥物研究所實驗動物中心提供。隨機均分為5組:沙棘脂肪酸組成分 (以下簡稱天癸)高、中、低劑量組、雌激素組、老年對照組;另將13只6月齡雌性大鼠為青年空白對照組。

2 方法

2.1 給藥方法

大鼠按0.01ml/kg體重每天定時灌胃給藥,各組劑量如下:天癸高、中、低劑量組依次為4.50g/kg、2.25g/kg、1.125g/kg;雌激素組給予已烯雌酚0.02mg/kg。青年及老年對照組給予賦形劑。連續(xù)給藥90d停藥,空腹12h后,麻醉,取樣。

2.2 標本制備

動脈插管取血約2ml,室溫靜置2h,離心取上清,分裝后-20℃冰箱保存。迅速開腹,取肝臟,冰浴條件下制備肝勻漿,0℃高速提取線粒體,部分用于測定線粒體呼吸功能,其余分裝后-20℃保存。

2.3 檢測

線粒體呼吸控制率 (RCR)、磷氧比 (P/O)及氧化磷酸化效率 (OPR)采用Clarck氧電極法測定線粒體呼吸功能各項指標[2]。

線粒體復合酶活性:按Veitch等的方法分別測定復合酶Ⅰ～Ⅳ活性[3]。

線粒體ATP合成酶活性:用無機磷檢測試劑盒測定Pi含量以代表ATP酶活性。線粒體ATP合成酶是一種可逆性酶,當ATP量遠多于ADP時,ATP合成酶分解ATP成ADP和無機磷,測定無機磷的量,可計算ATP合成酶的活性。

線粒體Ca2+-ATP酶活性:按照ATP酶測試盒說明操作。

線粒體琥珀酸脫氫酶活性:按照琥珀酸脫氫酶試劑盒說明操作。

2.4 統(tǒng)計學方法

應用統(tǒng)計軟件 SPSS11.5進行單因素方差分析。

3 結果

3.1 實驗大鼠一般狀況

各組大鼠基本狀況良好,用藥2周以后背毛變得有光澤,絨毛感增強,行動自如,未見其他異常表現(xiàn);老年對照組大鼠行動較為遲緩,毛色粗糙成束,脫毛現(xiàn)象比較普遍,老年特征明顯。

3.2 大鼠線粒體復合酶活性

與老年組相比,青年組及天癸高、中劑量組復合酶Ⅰ明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);青年組復合酶Ⅱ活性高于老年組 (P＜0.05);沙棘脂肪酸實驗組及雌激素組比老年對照組酶活性升高;青年組、沙棘脂肪酸高、中劑量組及雌激素組復合酶Ⅲ活性顯著高于老年組(P＜0.01或P＜0.05,);與老年組相比,青年組和雌激素組復合酶Ⅳ活性顯著升高 (P＜0.01或P＜0.05);沙棘脂肪酸組成分高中低劑量實驗組復合酶Ⅳ活性高于老年組呈升高趨勢,詳見表1。

表1 大鼠線粒體復合酶Ⅰ-Ⅳ活性測定結果(nmol.mg-1.min-1,x±s)

3.3 大鼠線粒體呼吸功能

與老年組比較,青年組、沙棘脂肪酸實驗組及雌激素組OPR升高,差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01或P＜0.05);青年組、沙棘脂肪酸中劑量組和雌激素組ADP/O比值高于老年組 (P＜0.01或P＜0.05);與老年組比較,青年組和雌激素組RCR(P＜0.05)、沙棘脂肪酸高中低實驗組RCR值升高 (P＞0.05)但呈升高趨勢,詳見表2。

表2 各組大鼠線粒體呼吸功能測定結果(nmol.mgprot-1.min-1,±s)

表2 各組大鼠線粒體呼吸功能測定結果(nmol.mgprot-1.min-1,±s)

注 與老年對照組比較 *P＜0.05,**P＜0.01。

組 別 劑 量(g/kg) n RCR ADP/O OPR脂肪酸高劑量 4.50 9 1.57±0.27 1.87±0.49 41.07±10.20*脂肪酸中劑量 2.25 9 1.59±0.34 1.96±0.65* 42.30±12.27*脂肪酸低劑量 1.125 10 1.47±0.32 1.87±0.45 39.32±10.85*雌激素 0.02×10-3 13 1.67±0.64* 1.96±0.58* 41.47±10.00*老年對照 等體積 9 1.26±0.19 1.45±0.22 25.07±4.54青年對照 等體積 11 1.73±0.39* 2.02±0.82** 46.18±13.39**

3.4 大鼠線粒體ATP合成酶活性

與老年組比較,沙棘脂肪酸實驗組高、中、低劑量組和青年組 ATP合成酶活性顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)。雌激素組ATP合成酶活性 (P＞0.05)見表3。

表3 各組大鼠線粒體ATP合成酶活性測定結果 (μ mol.mg-1.hour-1,±s)

表3 各組大鼠線粒體ATP合成酶活性測定結果 (μ mol.mg-1.hour-1,±s)

注 與老年對照組比較 *P＜0.05,**P＜0.01。

組 別 劑 量(g/kg) n ATP合成酶活性脂肪酸高劑量 4.50 12 0.31±0.04*脂肪酸中劑量 2.25 12 0.31±0.05**脂肪酸低劑量 1.125 13 0.29±0.08*雌激素 0.02×10-3 14 0.28±0.06老年對照 等體積 12 0.24±0.04青年對照 等體積 13 0.34±0.07**

3.5 大鼠線粒體Ca2+-ATP酶活性

與老年組比較,天癸高、中劑量組及青年組Ca2+-AT P酶活性明顯升高,差異顯著 (P＜0.01),其中沙棘脂肪酸高、中劑量組與青年組接近。雌激素組Ca2+-ATP酶活性 (P＞0.05)見表4。

3.6 大鼠琥珀酸脫氫酶活性

與老年組比較,青年組酶活性顯著升高 (P＜0.05),沙棘脂肪酸實驗組SDH酶活性呈升高趨勢,尤其是高劑量組升高值遠高于老年組和雌性激素組,見表5。

表4 各組大鼠線粒體Ca2+-ATP酶活性測定結果(μmol.mg-1.hour-1, ±s)

表4 各組大鼠線粒體Ca2+-ATP酶活性測定結果(μmol.mg-1.hour-1, ±s)

注 與老年對照組比較*P＜0.05,**P＜0.01。

組 別劑 量(g/kg)nCa2+-ATP酶活性脂肪酸高劑量4.50120.29±0.04**脂肪酸中劑量2.25120.29±0.04**脂肪酸低劑量1.125120.25±0.04雌激素0.02×10-3130.24±0.03老年對照等體積120.22±0.04青年對照等體積120.30±0.05**

表5 各組大鼠琥珀酸脫氫酶活性測定結果(U.mg-1.hour-1, ±s)

表5 各組大鼠琥珀酸脫氫酶活性測定結果(U.mg-1.hour-1, ±s)

注 與老年對照組比較 *P＜0.05,**P＜0.01。

組 別 劑 量(g/kg) n 琥珀酸脫氫酶活性脂肪酸高劑量 4.50 12 4.21±0.67脂肪酸中劑量 2.25 12 4.09±1.15脂肪酸低劑量 1.125 13 3.54±0.96雌激素 0.02×10-3 14 3.77±1.15老年對照 等體積 12 3.50±1.02青年對照 等體積 13 4.52±1.17*

4 討論

研究結果揭示,沙棘脂肪酸組成分可能對線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ～Ⅳ的質子泵起作用,并促進線粒體呼吸鏈傳遞電子過程。本動物試驗證實,沙棘脂肪酸組成分不僅改善了線粒體內膜復合酶Ⅰ～Ⅳ活性功能,使AT P合成酶生成顯著性增加,更重要的是藥物調節(jié)線粒體內膜蛋白質和輔酶成分,增強了機體的生物能量的轉換作用。本次試驗與前期的研究進行關聯(lián)分析顯示:沙棘脂肪酸組成分增強了復合酶Ⅰ～Ⅳ、ATP合成酶活性功能,激活了機體環(huán)核甘酸CAMP/CGMP第二信使,并產(chǎn)生生物功能的集合放大作用;調整了老齡雌性大鼠因衰老所致血清中的CAMP/CGMP濃度比值紊亂;并激活機體CAMP/PKA、Ca2+-ATP酶活性的信號調節(jié)通路[4]。

隨著年齡的增加,人的肝臟和骨骼肌中及其他組織中表現(xiàn)為線粒體的呼吸鏈的氧化代謝功能下降,氧化磷酸化效率降低,線粒體的結構受到破壞,呼吸鏈組成酶類和AT P的合成效率下降現(xiàn)象[5]。本實驗結果與文獻報道一致。

Ca2+作為普遍存在的細胞內第二信使,在細胞生命活動中起到重要作用。隨著年齡的增加,細胞內Ca2+呈漸進性增加。細胞內鈣超載對線粒體及能量代謝產(chǎn)生消極影響。細胞內游離鈣病理性增加之后,則需要細胞內的Ca2+調控機制發(fā)揮作用,以維持細胞內鈣穩(wěn)態(tài)。Ca2+-ATP酶在Ca2+的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。但研究發(fā)現(xiàn),隨著老齡化的發(fā)生,細胞內的Ca2+調控能力是逐漸衰退的,細胞膜鈣泵活性隨著年齡增加而顯著降低,外排Ca2+的能力明顯下降[6]。本實驗結果顯示,天癸實驗組Ca2+-ATP酶活性都顯著高于老年組,線粒體細胞膜鈣離子轉運能力提高,可以緩解細胞內鈣離子超載狀態(tài)。這與前期實驗結果藥物實驗組線粒體內游離鈣離子濃度明顯低于老年組相一致。

琥珀酸脫氫酶既是三羧酸循環(huán)的限速酶之一,又是線粒體內膜的標志酶。它的作用對肝細胞的觀察發(fā)現(xiàn),由核編碼的琥珀酸脫氫酶活性在衰老時沒有明顯的變化[7]。本實驗結果表明,老年組SDH活性與青年組比較無顯著性下降,沙棘脂肪酸組成分服藥組,其衰老大鼠下降的SDH活性含量達到改善并有升高趨勢。其SDH在體內三羧酸循環(huán)中是通過輔酶與脫氫酶結合形成變位酶的作用而改變琥珀酸的活性,還是SDH在體內代表獨立的催化實體起作用有待于在以后的實驗研究中加以證實。

綜上所述,沙棘脂肪酸組成分以線粒體作為抗衰老調控靶標,是因為線粒體參與人體三羧酸循環(huán)、氨基酸代謝、脂肪酸分解、電子傳遞、能量轉換、DNA復制和 RNA合成等生命運動的過程。沙棘脂肪酸組成分具有增強線粒體內膜蛋白輔酶活性,保護線粒體功能的抗氧化損傷,促進線粒體呼吸功能和氧化磷酸化功能,使線粒體的細胞新陳代謝功能 (放能、儲能、轉化能)得以在體內進行自主平衡性的調節(jié),而使DNA復制和 RNA合成得以正常進行達到調節(jié)抗衰老目的。

[1] 周志東,趙偉康,金國琴.老年大鼠線粒體能量代謝及其調控的研究 [J].中國老年學雜志,2001,21(3):208-210.

[2] 邱宏,金國琴,張學禮.調心方對氧化損傷型類AD大鼠能量代謝的影響[J].中藥藥理與臨床,2002,18(1):18-21.

[3] 熊杰,馮亦璞.丁基苯酞對線粒體呼吸鏈復合酶活性的影響 [J].藥學學報,1999,34(4):241-245.

[4] Hu R,Yuan BX,Wei XZ.Enhanced CAMP/PKA pathway by seabucthorn fatty acid in Aged rats[J].Pharmacol Exp Ther,2007,10(1):248-254.

[5] 陳永紅,杜冠華.線粒體與衰老[J].中國藥理學通報,2000,16(5):485-488.

[6] 馬鐵明.脾氣虛證、脾陽虛證和脾陰虛證老年大鼠模型心、腦組織中mtDNA缺失、呼吸鏈復合體酶活性的變化以及補益脾胃方藥作用機制的實驗研究[J].遼寧中醫(yī)學院,2004,10(1):23-27.

[7] 鄭國锠.細胞生物學 [M],4版.北京:高等教育出版社,2003:189-191.