手足口病危重型患兒淋巴細(xì)胞亞群及免疫球蛋白檢測(cè)

莫 揚(yáng)

莫 揚(yáng)

湖北省襄陽(yáng)市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，襄陽(yáng)441021

本文2011－09－19收到，2011－10－25修回，2011－10－28接受

手足口病是由腸道病毒引起的急性傳染病，以柯薩奇病毒A組16（Cox A16）型和腸道病毒71（EV71）型多見(jiàn)，多發(fā)生于學(xué)齡前兒童，尤以3歲以下發(fā)病率最高，為小兒常見(jiàn)的傳染病，患者和隱性感染者為傳染源，主要通過(guò)消化道、呼吸道和密切接觸等途徑傳播。病毒進(jìn)入人體后在腸壁細(xì)胞中增殖，增殖后可侵入血流，形成病毒血癥，在易被壓迫的部位如手、足血流中游離出來(lái)，再在這些部位的細(xì)胞中增殖并引起病變［1］。本文對(duì)60例手足口病危重型患兒進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞亞群及免疫球蛋白檢測(cè)，以探討手足口病患兒免疫功能變化，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

按照衛(wèi)生部醫(yī)政司發(fā)布的《手足口病診療指南（2010年版）》［2］確診為手足口病并符合入住ICU 指征的危重型患兒60例，其中男37例，女23例，年齡0.20～10.00歲，平均2.00歲。正常對(duì)照組30例為健康兒童，其中男17例，女13例，年齡0.50～8.00歲，平均2.50歲。

1.2 試劑和儀器

淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)單克隆抗體CD8－FITC、CD56－FITC、CD4－APC、CD19－APC、CD3Per CP、溶血素及流式細(xì)胞儀（型號(hào)FACSCalibur）均為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。免疫球蛋白Ig G、Ig A、Ig M 檢測(cè)試劑由德國(guó)SIEMENS公司提供，特定蛋白儀型號(hào)為BN Prospec。

1.3 淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定方法

采集患兒入院治療前及健康兒童空腹靜脈血2 ml，以EDTA－K2抗凝。測(cè)試分兩管進(jìn)行，每管取細(xì)胞數(shù)1×106／ml，采用三色直接標(biāo)記，分別加入CD8－FITC／CD3Per CP／CD4－APC 、CD56－FITC／CD3Per CP／CD19－APC 各 20μl，室溫暗處孵育15 min，加入溶血素溶血10 min，1 500r／min離心5 min，加PBS洗滌后上機(jī)分析，每測(cè)定管獲取10 000個(gè)細(xì)胞。測(cè)定結(jié)果采用Cellquestpro軟件分析：首先以FSC／SSC設(shè)門(mén)圈定淋巴細(xì)胞，然后分別以CD3－FITC／CD8－PE、CD3－FITC／CD4－APC、CD3－FITC／CD56－PE、CD3－FITC／CD19－APC的二維散點(diǎn)圖確定CD抗原結(jié)合相應(yīng)抗體的表達(dá)率。

1.4 免疫球蛋白測(cè)定方法

采集患兒入院治療前及健康兒童空腹靜脈血2 ml，3 000r／min離心10 min，分離血清，使用BN Prospec特定蛋白儀檢測(cè)，方法學(xué)原理為免疫散射比濁法。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用EXCEL軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。檢測(cè)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)

手足口病危重型患兒外周血T淋巴細(xì)胞（CD3＋CD19－）、輔助 T細(xì)胞 Th（CD3＋CD4＋）、抑制T細(xì)胞Ts（CD3＋CD8＋）數(shù)明顯低于健康對(duì)照組，B淋巴細(xì)胞（CD3－CD19＋）數(shù)則較健康對(duì)照組增高，NK細(xì)胞（CD3－CD56＋）數(shù)及 Th／Ts比值無(wú)明顯變化，見(jiàn)表1。

表1 手足口病危重型患兒組與健康對(duì)照組淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定結(jié)果（±s）

表1 手足口病危重型患兒組與健康對(duì)照組淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定結(jié)果（±s）

注：與健康對(duì)照組比較，1）P＜0.05

Ts健康對(duì)照組 30 67.78±6.13 35.69±5.88 26.98±5.67 16.19±4組別 n T（%） Th（%） Ts（%） B（%） NK（%） Th／13.01±7.79 1.59±0.67.96 11.25±4.71 1.51±0.54疾病組 60 50.60±13.36 1） 28.13±9.62 1） 19.03±5.72 1） 33.73±11.56 1）

2.2 兩組免疫球蛋白檢測(cè)結(jié)果

手足口病危重型患兒免疫球蛋白Ig G、Ig A水平明顯高于健康對(duì)照組，而兩組間Ig M水平無(wú)明顯差異，見(jiàn)表2。

表2 手足口病危重型患兒組與健康對(duì)照組免疫球蛋白測(cè)定結(jié)果（±s）

表2 手足口病危重型患兒組與健康對(duì)照組免疫球蛋白測(cè)定結(jié)果（±s）

注：與健康對(duì)照組比較，1）P＜0.05

組別 n Ig G（g／L） Ig A（g／L） Ig M（g／L）健康對(duì)照組1.39±0.11 30 7.89±1.25 0.51±0.20 1.36±0.29疾病組 60 9.78±1.79 1）0.88±0.39 1）

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示手足口病患兒外周血T淋巴細(xì)胞減低。T細(xì)胞在腸道病毒感染后的免疫發(fā)病機(jī)制中起介導(dǎo)作用［3］，其數(shù)量減低說(shuō)明細(xì)胞免疫功能下降。Th細(xì)胞在免疫應(yīng)答中起輔助、誘導(dǎo)作用，還分泌細(xì)胞因子，啟動(dòng)遲發(fā)性超敏反應(yīng)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化。Th細(xì)胞按分泌細(xì)胞因子不同又分為T(mén)h0、Th1、Th2、Th3四種亞型，其分泌的細(xì)胞因子如白介素－2、γ－干擾素等在免疫應(yīng)答中起十分重要的作用。Ts細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)清除病毒感染有重要作用，其產(chǎn)生依賴(lài)于Th細(xì)胞的存在。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)手足口病患兒細(xì)胞免疫功能下降，病毒可能直接攻擊T細(xì)胞，使其迅速裂解破壞，并破壞免疫系統(tǒng)，引起T細(xì)胞異常分布，導(dǎo)致患兒T淋巴細(xì)胞、Th細(xì)胞、Ts細(xì)胞的百分率均下降。

B淋巴細(xì)胞及免疫球蛋白可反應(yīng)機(jī)體體液免疫功能，有學(xué)者［4］研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞免疫發(fā)育尚不成熟的手足口病患兒中，若自身細(xì)胞免疫弱于體液免疫，感染EV71后有進(jìn)展為重癥手足口病的傾向。本文觀(guān)察對(duì)象即為手足口病危重型患兒，其B淋巴細(xì)胞的百分率顯著增高，免疫球蛋白Ig G、Ig A水平明顯高于健康對(duì)照組，說(shuō)明患兒體液免疫增強(qiáng)，進(jìn)一步證實(shí)了上述觀(guān)點(diǎn)。B淋巴細(xì)胞增高可能與機(jī)體增強(qiáng)抗病毒抗體、中和病毒作用有關(guān)。

NK細(xì)胞屬于固有免疫細(xì)胞，無(wú)需抗原的預(yù)先刺激與活化即可發(fā)揮細(xì)胞毒作用，并分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，為抗病毒免疫的第一道防線(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中NK細(xì)胞在手足口病危重型患兒中的百分率增加不明顯，反映EV71病毒感染的危重期，固有免疫的作用已不能使疾病恢復(fù)，需啟動(dòng)不同類(lèi)型的特異性免疫反應(yīng)［5］，如能進(jìn)一步提高NK細(xì)胞比例和增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性，將有利于疾病的早期痊愈或減少心肌并發(fā)癥的發(fā)生［6］。

有關(guān)手足口病患兒外周血淋巴細(xì)胞亞群和免疫球蛋白含量的報(bào)道，結(jié)果［7～9］不完全一致，這可能與病例選擇分組及所用試劑、方法不同有關(guān)，有待大樣本的檢測(cè)結(jié)果證實(shí)。但可以確定的是手足口病危重癥患兒體內(nèi)存在免疫功能紊亂，提示在患兒治療過(guò)程中可以適當(dāng)給予免疫調(diào)節(jié)藥物治療。

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