淀粉糊化過(guò)程的數(shù)字圖像分析技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)*

高群玉 謝欽

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640)

淀粉是食品中最常見(jiàn)的碳水化合物，淀粉相變或糊化過(guò)程對(duì)于食品加工非常重要［1］.淀粉糊化的研究始于19世紀(jì)初，但至今這種水熱處理導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)上的轉(zhuǎn)變過(guò)程仍未被理解透徹［2］.目前比較常見(jiàn)的定義為:當(dāng)?shù)矸墼谒屑訜釙r(shí)，其多晶性逐漸消失，導(dǎo)致了結(jié)構(gòu)上的破壞，這種由熱導(dǎo)致的淀粉顆粒破壞或者由規(guī)則結(jié)構(gòu)向不規(guī)則轉(zhuǎn)變的相變過(guò)程稱(chēng)為糊化［3］.

淀粉顆粒在經(jīng)歷各種熱加工過(guò)程和單元操作后，會(huì)處于部分甚至全部糊化的不同階段，從而影響食品的功能和結(jié)構(gòu)性質(zhì)［4］.因此監(jiān)測(cè)和控制淀粉的糊化程度具有重要意義.

原淀粉的結(jié)構(gòu)以分子尺度、薄層尺度、生長(zhǎng)圈尺度和整個(gè)淀粉顆粒尺度4種不同的尺度進(jìn)行分層組合，這4種尺度層次都與糊化現(xiàn)象相關(guān)聯(lián)［3］.淀粉的糊化及相關(guān)性質(zhì)可以用許多基于化學(xué)、酶學(xué)和物理學(xué)的實(shí)驗(yàn)手段和技術(shù)測(cè)量得到，包括測(cè)量雙十字消失點(diǎn)、差式掃描量熱儀(DSC)/熱機(jī)械分析儀檢測(cè)熱焓變化、核磁共振等［4］.這些方法的原理不同，它們從不同的角度表征淀粉的糊化特性，測(cè)量得到的物化性質(zhì)有一定的差異，各自獨(dú)特而又相互聯(lián)系.

雙折射被用來(lái)表征光波長(zhǎng)度約為500 nm尺度下的顆粒的規(guī)則結(jié)構(gòu)［3］.使用帶有偏光的熱臺(tái)顯微鏡觀察淀粉顆粒的糊化過(guò)程時(shí)，2%和98%的顆粒失去偏光時(shí)的溫度分別被定義為糊化起始溫度和糊化終止溫度，后者也常被稱(chēng)為雙折射結(jié)束點(diǎn)溫度［5］.DSC的結(jié)果包括用以描述當(dāng)加熱淀粉－水混合物時(shí)吸熱轉(zhuǎn)換的譜圖、與破壞淀粉結(jié)構(gòu)所需能量有關(guān)的糊化焓值及反映淀粉有序結(jié)構(gòu)被破壞的溫度范圍的糊化溫度(糊化吸熱的起始、峰值和終點(diǎn)糊化溫度)，這些數(shù)據(jù)提供了與糊化機(jī)理、淀粉顆粒結(jié)構(gòu)和性質(zhì)等相關(guān)的諸多信息［6］.

數(shù)字圖像分析技術(shù)被運(yùn)用于醫(yī)學(xué)、地質(zhì)和食品質(zhì)量控制等多個(gè)領(lǐng)域［7-9］，它們主要是通過(guò)采集有關(guān)數(shù)字照片后，使用專(zhuān)業(yè)圖像分析軟件對(duì)所關(guān)心的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行諸如數(shù)量、尺寸、顏色和光強(qiáng)度等方面的分析，得到相關(guān)數(shù)據(jù).淀粉的膨脹糊化過(guò)程也可利用圖像分析軟件進(jìn)行研究，如Parada等［10］分析了馬鈴薯淀粉保溫糊化過(guò)程中的粒徑累積分布、顆粒尺寸和長(zhǎng)短徑比，得到了馬鈴薯淀粉糊化剩余顆粒與血糖值響應(yīng)的關(guān)系;Blennow等［11］針對(duì)玉米淀粉在含有蔗糖和水凝膠的水體系中的膨脹過(guò)程，建立了數(shù)學(xué)模型.

光密度(OD)分析被廣泛運(yùn)用于生物醫(yī)學(xué)特別是分子生物學(xué)試驗(yàn)樣品中，它能間接反應(yīng)樣品中陽(yáng)性物質(zhì)的相對(duì)含量，常被用來(lái)測(cè)量細(xì)胞染色后的陽(yáng)性反應(yīng)值.而樣品上某一部位內(nèi)的IOD值(定義為該部位所在區(qū)域內(nèi)的所有像素點(diǎn)的OD值的總和)與該部位內(nèi)所含的陽(yáng)性物質(zhì)的總量成正比［12-13］，因此，筆者將淀粉顆粒的晶體結(jié)構(gòu)看作“陽(yáng)性物質(zhì)”，基于晶體結(jié)構(gòu)的強(qiáng)弱與其在偏振光下的雙折射光亮度成正比的特點(diǎn)，提出了累積光密度法，即利用圖像處理軟件Image-Pro Plus 5.0處理分析淀粉糊化過(guò)程的偏光圖片，得到表示淀粉結(jié)晶結(jié)構(gòu)強(qiáng)弱的偏光IOD值，然后用IOD值進(jìn)行計(jì)算得到糊化度.此外，還將累積光密度法與偏光十字顆粒消失法、剩余偏光十字面積法和DSC焓變積分法進(jìn)行了比較.

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

主要材料與儀器如下:馬鈴薯淀粉，嵩天集團(tuán)有限公司生產(chǎn);THMSE600型熱臺(tái)，LINRAM公司生產(chǎn);裝配有Micro Publisher 3.3 RTV型數(shù)碼相機(jī)的偏光顯微鏡，Olympus公司生產(chǎn);DSC8000型DSC，PerkinElmer公司生產(chǎn).

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 偏光圖片的采集

淀粉乳(水分含量約為80%)適量，密封于兩片圓形蓋玻片之間，置于裝配有數(shù)碼相機(jī)的熱臺(tái)偏光顯微鏡下，先以5℃/s升溫至40℃，然后以2℃/s升溫，于不同溫度點(diǎn)在線拍攝得到淀粉糊化過(guò)程的數(shù)碼照片，實(shí)驗(yàn)記錄的溫度范圍為40～80℃，40～60℃階段每5℃、60～80℃階段每2℃采集一張數(shù)碼照片.此外，將一個(gè)視頻監(jiān)視器連接照相機(jī)輸出顆粒雙十字的在線圖像.圖像保存格式為T(mén)IFF，大小為2048×1536.

1.2.2 DSC 測(cè)量

稱(chēng)量一定量淀粉，加蒸餾水配成一定濃度(淀粉干基/水質(zhì)量比為1∶4)的淀粉乳，密封在高壓不銹鋼DSC盤(pán)中，在室溫下平衡2h后進(jìn)行掃描.氮?dú)馔ㄈ胨俣葹?0mL/s，升溫程序與熱臺(tái)實(shí)驗(yàn)相同.

1.2.3 4 種糊化度檢測(cè)方法

累積光密度法(簡(jiǎn)稱(chēng)IOD法):利用Image-Pro Plus 5.0計(jì)算出每張數(shù)碼圖片的IOD值為初測(cè)IOD值，定義所有雙折射光消失的圖片的IOD值為背景IOD值，所以每張圖片上淀粉顆粒的實(shí)際IOD值=初測(cè)IOD值－背景IOD值.IOD法測(cè)得的糊化度(DI)=(1－實(shí)際IOD值/40℃時(shí)的實(shí)際IOD值)×100%.

剩余偏光十字面積法(簡(jiǎn)稱(chēng)面積法):Parada等［10］認(rèn)為淀粉偏光區(qū)域的多角形面積與糊化度有良好的相關(guān)性(r2=0.975).所以，用軟件Image-Pro Plus 5.0自動(dòng)識(shí)別出淀粉未糊化的多角形偏光區(qū)域，并計(jì)算它的面積.面積法測(cè)得的糊化度(DA)=(1－剩余偏光面積/初始總面積)×100%.

偏光十字顆粒消失法(后稱(chēng)數(shù)顆粒法):以偏光十字完全消失為標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)淀粉顆粒的數(shù)量.數(shù)顆粒法測(cè)得的糊化度(DC)=偏光十字消失的顆粒數(shù)/初始總顆粒數(shù)×100%.

DSC焓變積分法(簡(jiǎn)稱(chēng)DSC法):用DSC自帶的Pyris軟件，分析淀粉的糊化焓值譜圖.某溫度點(diǎn)的糊化度為從峰起始點(diǎn)到該溫度的積分面積占整個(gè)糊化溫度范圍內(nèi)積分面積的比例.DSC法測(cè)得的糊化度(DD)=為某特定溫度點(diǎn)，T0為起始糊化溫度，T為某一溫度點(diǎn).

文中初始狀態(tài)是指40℃時(shí)的狀態(tài)，所有數(shù)據(jù)為4次平行實(shí)驗(yàn)的平均值.

2 結(jié)果與分析

2.1 普通光及偏光圖片

圖1示出了升溫過(guò)程中不同溫度點(diǎn)馬鈴薯淀粉在普通光下的照片(左邊圖)及其對(duì)應(yīng)的偏振光下的雙折射光照片(右邊圖).在整個(gè)糊化過(guò)程中，淀粉顆粒經(jīng)歷了膨脹、偏光十字減弱直至消失的過(guò)程.在糊化過(guò)程中，顆粒有3種狀態(tài):全部糊化(偏光完全消失)、部分糊化(偏光面積減少，亮度減弱)及未糊化(偏光基本沒(méi)有變化).在糊化中期，大部分淀粉都處于部分糊化這一中間狀態(tài).淀粉顆粒在較低溫度下(50℃之前)便發(fā)生了細(xì)微的膨脹(用圖像分析軟件可以測(cè)量到)，特別是有破損的顆粒，膨脹更早更劇烈，同時(shí)伴隨雙折射光的明顯減弱.這可能與水分對(duì)淀粉顆粒更好的浸潤(rùn)有關(guān).由圖1可知，一張圖片可以觀察到1000個(gè)以上淀粉顆粒，因此文中提出的方法可實(shí)現(xiàn)淀粉在顯微鏡下的較高密度觀察，減少了實(shí)驗(yàn)工作量.

圖1 馬鈴薯淀粉在升溫過(guò)程中不同溫度下的普通光照片和偏光照片F(xiàn)ig.1 Micrographs of potato starch at different temperatures during heating process respectively under normal light and polarized light

2.2 4種糊化度檢測(cè)方法的比較

圖2示出了用4種糊化度檢測(cè)方法測(cè)得的馬鈴薯淀粉的溫度－糊化度曲線.在同一溫度下，4種方法測(cè)得的糊化度大小順序是DI＞DA＞DC＞DD.這種差別與它們的測(cè)量原理有關(guān).DI值是與面積和OD值都相關(guān)的函數(shù)，面積對(duì)應(yīng)的是淀粉結(jié)晶結(jié)構(gòu)數(shù)量的多少，OD則與淀粉結(jié)晶程度的強(qiáng)弱成正比.DA只是面積的函數(shù)，因此無(wú)法表征結(jié)晶程度減弱但未消失的部分，圖2顯示，DA在溫度較低時(shí) (55℃以下)出現(xiàn)負(fù)值，這是因?yàn)榈矸垲w粒膨脹，使偏光面積增大，但仍未達(dá)到使偏光消失的程度.因此IOD法的準(zhǔn)確性和靈敏度更高.傳統(tǒng)的數(shù)顆粒法關(guān)注的只有淀粉顆粒的數(shù)量，而數(shù)量本身甚至不是一個(gè)幾何參數(shù)［10］，所以該方法同樣無(wú)法表征出處于部分糊化的淀粉的狀態(tài)，其準(zhǔn)確性和靈敏度在3種利用偏光顯微鏡測(cè)量淀粉糊化度的方法中都是最低的.

圖2 4種檢測(cè)方法的糊化度Fig.2 Gelatinization degrees detected by four methods

由圖2可知，當(dāng)馬鈴薯淀粉懸浮在過(guò)量水中并加熱時(shí)，其整體結(jié)晶程度在較低溫度下(50℃以下)便開(kāi)始降低，低于用其它3種方法測(cè)得的糊化起始溫度.這與許多研究者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，即淀粉在較低溫度下糊化便已經(jīng)開(kāi)始.但是眾多結(jié)論所用的檢測(cè)指標(biāo)不一樣.Liu等［14］聯(lián)用 X射線衍射儀(XRD)、DSC和熱臺(tái)偏光顯微鏡，發(fā)現(xiàn)淀粉的結(jié)晶度在顆粒還未開(kāi)始消失之前以及雙折射光消失之后都在降低.Wajira等［4，15］為避免淀粉在經(jīng)歷如冷卻、干燥和與水再生這些后處理后，結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而對(duì)DSC結(jié)果造成影響，在DSC中完成整個(gè)保溫、冷卻預(yù)處理過(guò)程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)淀粉的相轉(zhuǎn)變?cè)谳^低溫度下(如30℃)便已經(jīng)發(fā)生了.這說(shuō)明，為更精確地了解淀粉糊化行為信息，應(yīng)盡可能使用能實(shí)時(shí)在線檢測(cè)淀粉糊化的儀器，以減少各種預(yù)、后處理對(duì)淀粉結(jié)構(gòu)的影響.IOD法可實(shí)時(shí)在線動(dòng)態(tài)測(cè)量淀粉的結(jié)晶情況，能夠真實(shí)、準(zhǔn)確地反映糊化過(guò)程中具體溫度下淀粉的狀態(tài)，這是XRD分析無(wú)法做到的.盡管XRD分析作為測(cè)量淀粉結(jié)晶度的方法被廣泛應(yīng)用，但是它并不是一種實(shí)時(shí)在線的測(cè)量方法，無(wú)法避免各種后處理對(duì)原淀粉樣品的影響.IOD法重復(fù)性較好，DI在糊化前期(小于62℃)及糊化后期(大于70℃)的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1%，在糊化中期(60～68℃)小于5%.

Chiotelli等［16］研究發(fā)現(xiàn)，小麥淀粉乳加熱過(guò)程中，在DSC上有任何可見(jiàn)的吸熱現(xiàn)象發(fā)生前，儲(chǔ)能模量在50℃便開(kāi)始急劇增加，他們認(rèn)為這個(gè)溫度對(duì)應(yīng)淀粉結(jié)構(gòu)中的液晶轉(zhuǎn)換過(guò)程(從近晶狀向無(wú)向性轉(zhuǎn)變)，即雙螺旋從微晶上解離的開(kāi)始.雖然文中實(shí)驗(yàn)所用的馬鈴薯淀粉與小麥淀粉在結(jié)構(gòu)上有所不同，但是馬鈴薯淀粉更易發(fā)生淀粉－水相互作用，在更低的溫度下便發(fā)生了膨脹［16］.因此，筆者認(rèn)為IOD法在糊化開(kāi)始初期測(cè)得的淀粉總體結(jié)晶程度的降低對(duì)應(yīng)的是淀粉遠(yuǎn)程有序結(jié)構(gòu)的減小，即淀粉顆粒的膨脹以及雙螺旋從微晶一側(cè)脫離，導(dǎo)致結(jié)晶程度的部分損失，故IOD法對(duì)淀粉結(jié)晶程度的變化具有較高的靈敏性.

由圖2中的數(shù)據(jù)計(jì)算可知，DSC結(jié)果在60℃之后才顯示出明顯的吸熱現(xiàn)象，這個(gè)溫度對(duì)應(yīng)的是1%淀粉顆粒的膨脹瓦解(數(shù)顆粒法)，4.2%結(jié)晶部分的消失(面積法)以及6.7%結(jié)晶程度的降低(IOD法).在60℃之后，同一溫度下4種方法測(cè)得的糊化度中DD最小，因?yàn)镈SC譜圖反映的是凈吸熱焓變過(guò)程，這與淀粉吸水膨脹、晶體結(jié)構(gòu)的融化以及交鏈淀粉的雙螺旋解旋等因素有關(guān)，體系需要更高的溫度推進(jìn)淀粉糊化過(guò)程.進(jìn)行IOD法和DSC法測(cè)得的同一糊化度對(duì)應(yīng)的溫度的回歸分析，發(fā)現(xiàn)兩者具有良好的線性相關(guān)性(見(jiàn)圖3，r2=0.996)，這與Liu等［14］的研究結(jié)果相符，他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)有足夠的水做塑化劑時(shí)，雙折射結(jié)束點(diǎn)溫度與DSC得到的轉(zhuǎn)變溫度有良好的相關(guān)性，淀粉糊化時(shí)結(jié)晶結(jié)構(gòu)的消失與熱轉(zhuǎn)變存在定量關(guān)系，因?yàn)榫w的融化是伴隨熱效應(yīng)而發(fā)生的一級(jí)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變.

圖3 同一糊化度下IOD法與DSC法對(duì)應(yīng)的溫度之間的關(guān)系Fig.3 Relationship between the temperature of IOD method and that of DSC method at the same gelatinization degree

圖4顯示，糊化進(jìn)程中對(duì)應(yīng)于同一溫度的DI與DD呈對(duì)數(shù)相關(guān)(r2=0.999).DI在10%左右時(shí)，DD才開(kāi)始緩慢增大，當(dāng)DI大于70%后，DD開(kāi)始迅速增加.DSC法測(cè)得馬鈴薯淀粉在過(guò)量水中的糊化峰值溫度為69.1℃，這個(gè)溫度點(diǎn)對(duì)應(yīng)的DI為72.9%，DD為51.4%.IOD法和DSC法測(cè)得的糊化度既相互區(qū)別又相互聯(lián)系.在過(guò)量水中，淀粉的DSC譜圖顯示的單峰是由G峰(螺旋－螺旋解離)和M1峰(支鏈淀粉雙螺旋解離)合并而來(lái)的［6］.螺旋－螺旋解離對(duì)應(yīng)的主要是淀粉結(jié)晶有序結(jié)構(gòu)的降低，而雙螺旋解離則對(duì)應(yīng)于分子有序結(jié)構(gòu)的降低，它們都伴隨著吸熱過(guò)程，兩者在過(guò)量水中同時(shí)發(fā)生.IOD值反映的淀粉糊化要比DSC的提前，因?yàn)榈矸酆瘯r(shí)結(jié)晶結(jié)構(gòu)的減弱要比可檢測(cè)到的DSC熱焓信號(hào)更早.隨著溫度進(jìn)一步增加，便有了足夠的能量來(lái)破壞所有剩下的遠(yuǎn)程有序結(jié)構(gòu)以及分子有序結(jié)構(gòu).

圖4 同一溫度下DI與DD的關(guān)系Fig.4 Relationship between DIand DDat the same temperature

3 結(jié)語(yǔ)

文中提出了一種基于IOD值的用數(shù)字圖像分析技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)淀粉糊化過(guò)程的新方法，它以光波長(zhǎng)度約為500nm尺度下淀粉的有序結(jié)構(gòu)為指標(biāo)，定量得到淀粉在糊化過(guò)程中實(shí)時(shí)的結(jié)晶程度變化情況，具有準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn).IOD法與傳統(tǒng)的利用淀粉顆粒結(jié)晶雙折射特性的方法相比，具有明顯的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗軌驅(qū)μ幱诓糠趾癄顟B(tài)的淀粉顆粒進(jìn)行表征，同時(shí)，它是一種實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的方法，免去了各種樣品的預(yù)、后處理，所以得到的數(shù)據(jù)能更好地反映樣品糊化過(guò)程的真實(shí)情況.

用IOD法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)淀粉糊化過(guò)程，特別是在與其它儀器聯(lián)用時(shí)，能夠反映出糊化過(guò)程中的淀粉結(jié)構(gòu)與性質(zhì)變化的諸多信息，具有快捷、成本低的特點(diǎn)，是一種值得推廣的淀粉糊化研究新方法.

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